谷氨酸转运体4b-4c环关键氨基酸残基位点的鉴定及功能研究

发布时间：2021-09-28 07:41

　　谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基酸递质,因其不能在胞外代谢,胞外溶液中多余的谷氨酸只能依靠谷氨酸转运体（兴奋性氨基酸转运体,excitatory amino acid transporters,EAATs）进行回收利用,否则突触间隙内过量的谷氨酸会造成神经元的兴奋性毒性损伤。因此,谷氨酸转运体在预防神经兴奋性毒性方面极为重要。真核EAAT和原核谷氨酸转运体具有相似的蛋白结构,它们均由三个相同的楔形亚基聚合而成,但与原核相比,EAAT的4b-4c环多了 50多个氨基酸残基,提示EAAT的4b-4c环可能具有不一样的作用。虽然EAATlcryst的晶体结构已破解,但其4b-4c环的原有残基中,有26个被删除了且有18个被突变了,因而无法反映4b-4c环天然的结构信息。考虑到4b-4c环与EAATs的功能及亚细胞定位密切相关,我们推测环上可能存在某些影响蛋白活性的关键氨基酸残基;另外,由于4b-4c环在转运过程中还支持螺旋发卡环（helical hairpin,HP）1、HP2及跨膜区段（transmembrane domain,TM）7参与局部变构,我们推测4b-4c环与TM8之间... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：123 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图２．?ＥＡＡＴｓ的转运模式

层膜内底物结合位点的侧面为蛋白的内外闸门，而内外闸门的运动使底物得以??交替接近细胞内外的溶液［４２］，从而表现为蛋白在向外开放时相、底物结合时相??以及向内开放时相之间的循环变构（图３?）。在变构过程中，外侧闸门ＨＰ２首先??移向胞外并暴露底物的结合位点，然后在转运体与底物、离子结合后恢复闭合??态，接着，底物结合区（主要包括ＨＰ１、ＨＰ２、ＴＭ７及ＴＭ８的部分区段）向胞??浆侧移动，转运体逐渐过渡到向内开放构象，直至内侧闸门ＨＰ１向内开放并将??底物和离子释放至胞内１４２＿４４］，最后，Ｋ＋与向内开放的转运体结合，进而促使转??运体变构为向外开放的初始态［４３］。由于最后一步是整个转运周期的限速步骤

Ａ２１２、Ａ２２０和Ａ２４３）被突变为缬氨酸（因缬氨酸也是非极性氨基酸，且侧链??比丙氨酸的侧链稍大），这步突变的目的在于查看四个原有的丙氨酸残基是否也??显著影响ＥＡＡＴ１的正常功能。结果如图１－１所示，与野生型ＥＡＡＴ１相比，超过??９０％的突变体对Ｄ－［３Ｈ］－Ａｓｐａｔａｔｅ仍保留了?６０％以上的摄取活性。而Ｔ１９２Ａ、??Ｙ１９４Ａ、Ｎ２４２Ａ及Ｇ２４５Ａ突变体的摄取活性显著下降，它们对Ｄ－［３Ｈ］－Ａｓｐａｔａｔｅ??的摄取活性分别为（４．２５?±２．２５）?％、（１２．８２?±７．２１）?％、（９．０１?±２．５７）?％和（８．１０??±４．５９）?％?（ｎ?＝?３）。我们发现Ｔ１９２、Ｙ１９４、Ｎ２４２及Ｇ２４５四个氨基酸残基恰巧??集中分布于４ｂ－４ｃ环两端，而这两端也是４ｂ－４ｃ环最接近转运体底物结合袋的部??位（图１．１?Ｂ）。综合以上结果分析，Ｔ１９２、Ｙ１９４、Ｎ２４２和Ｇ２４５很可能是ＥＡＡＴ１??完成底物转运所必需的关键氨基酸残基，因此，本研宄选择围绕这四个位点的??氨基酸残基做进一步分析。??３７??


本文编号：3411508