SIDT2在脂肪组织自噬和分化成熟中的机制研究

发布时间：2021-09-28 07:55

　　目的:溶酶体膜蛋白SIDT2的缺失在小鼠脂肪组织自噬和分化成熟过程中潜在机制初探。方法:本实验通过采用Cre/loxp重组酶系统构建全身Sidt2基因敲除的小鼠模型,利用腺病毒感染3T3-L1前脂肪细胞获得Sidt2基因剔除的3T3-L1细胞模型。借助western blot检测小鼠脂肪组织和3T3-L1前脂肪细胞自噬通路关键蛋白表达情况。在发现Sidt2基因缺失小鼠脂肪组织和细胞均出现自噬途径受阻后,进一步使用影响自噬途径的药物氯喹、雷帕霉素、3-MA以及免疫荧光等实验方法更深一层探讨Sidt2基因在小鼠脂肪组织自噬途径中如何发挥作用。通过HE染色检测小鼠脂肪组织切片改变,油红O染色检测Sidt2基因剔除3T3-L1前脂肪细胞诱导分化变化情况,并继续从蛋白水平检测脂肪细胞诱导分化过程关键因子的表达变化情况。进一步探讨Sidt2、自噬和脂肪细胞分化三者之间的是否存在某种关系。结果:1.成功获得Sidt2基因剔除的小鼠模型和细胞模型并在基因和蛋白水平予以检测确定造模成功。2.蛋白水平检测自噬途径关键蛋白LC3B、P62等发现Sidt2基因剔除小鼠脂肪组织和3T3-L1细胞自噬通路受阻碍。... 

【文章来源】：皖南医学院安徽省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图为野生鼠外观

图 2 正常野生鼠和剔除鼠脂肪组织中 Sidt2 蛋白表达情况（**为 P<0.01 vs.control,n=3 ）。1.2 Sidt2 基因剔除 3T3-L1 前脂肪细胞模型构建和鉴定利用本实验室已有的敲除 Sidt2 基因的 AdEasy 腺病毒（实验室师弟制备）感染 3T3-L1细胞 4h 后继续新鲜培养液培养 48h，因所感染腺病毒带 GFP 标签，镜下可观察细胞表达绿色荧光（如图 3 所示）。细胞培养 72h 后观察细胞密度基本已达 80-90%，对细胞进行传代，其中一半细胞用来提取 RNA，逆转录成 cDNA 通过 qPCR 鉴定细胞 Sidt2 基因敲除率，结果显示基因剔除率可达 80%左右(如图 6 所示)。剩下的一半细胞继续用含嘌呤霉素的培养液继续培养，培液中的嘌呤霉素可继续筛除未转染成功的 3T3-L1前脂肪细胞。

图 3 3T3-L1 前脂肪细胞感染 AdEasy 腺病毒敲除 Sidt2 基因后鉴定结果。图 A-B 为 3T3-L1 前脂细胞感染腺病毒后荧光显微镜下可见细胞表达 GFP 绿色荧光蛋白；图 C 为剔除 Sidt2 基因得 3T3前脂肪细胞提取细胞 RNA 逆转录成 cDNA 后通过 qPCR 鉴定结果（**为 P<0.01，vs.control,n=3）1.3 Sidt2 基因剔除自噬途径关键蛋白表达情况1.3.1 Sidt2 基因剔除小鼠脂肪组织自噬通路关键蛋白表达情况提取 Sidt2 全身剔除小鼠附睾脂肪组织总蛋白后，通过 western blot 检测自噬通路关键蛋白的表达情况。结果发现，与野生小鼠体内各蛋白表达量相比较，Sidt2 纯合子小鼠自噬通路关键蛋白 P62、LC3B、ATG5、Beclin1 明显增多，而 ATG7 又表现出相反的减少趋势，ATG12 表达未见明显改变（如图 4 所示）。


本文编号：3411527