PLIN1基因敲除对3T3-L1细胞脂解的影响及机制探究

发布时间：2021-09-29 20:48

　　目的:构建PLIN1基因敲除载体,敲除3T3-L1前脂肪细胞中PLIN1基因,有效降低PLIN1蛋白的表达,研究脂肪细胞中PLIN1基因敲除对脂肪水解的影响,并探究其机制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技术,双酶切法构建PLIN1基因敲除载体,DNA测序技术鉴定载体;常规培养3T3-L1前脂肪细胞,PCR扩增PLIN1基因目的片段;sgRNA体外转录,Cas9体外酶切,鉴定sgRNA活性。2.电穿孔转染3T3-L1前脂肪细胞,嘌呤霉素筛选转染成功的细胞;优化的“鸡尾酒”法,诱导3T3-L1前脂肪细胞分化;Western blot检测脂肪细胞中PLIN1蛋白的表达,RT-PCR检测PLIN1 mRNA相对表达量,检验阳性载体的敲除作用。3.油红O染色脂肪细胞中脂滴,测量脂滴大小、读计脂滴数量;酶法测定脂肪细胞中甘油三酯和甘油含量,了解细胞脂解情况;Western blot法检测细胞中脂解酶、Fsp27、PPARγ蛋白表达,RT-PCR检测细胞中HSL、ATGL mRNA相对表达量。结果:1.3个sgRNA均可以识别PLIN1基因靶点,发挥作用,体外酶切活性检测均有效;3个敲除载体的... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

PX459质粒结构图

图 1-2 PLIN1 敲除载体测序图2.2 PLIN1 目的片段 PCR 扩增结果2.2.1 PLIN1 目的片段扩增引物根据引物设计原则以及CRISPR基因敲除原理，设计PLIN1基因PCR扩增引物，上下游引物为：PLIN1-F：5’- GCAGAGGTAGACAGCCCAAG -3’；PLIN1-R：5’-TCCTGCCACTGGTCCTACTC-3’。2.2.2 PLIN1 目的片段琼脂糖凝胶结果如图 1-3 所示琼脂糖凝胶电泳后目的条带约处于 800 bp 左右，与预期结果（781bp）相同。

图 1-2 PLIN1 敲除载体测序图片段 PCR 扩增结果片段扩增引物计原则以及CRISPR基因敲除原理，设计PLIN1基因PCPLIN1-F：5’- GCAGAGGTAGACAGCCCAAG -3’；GTCCTACTC-3’。片段琼脂糖凝胶结果琼脂糖凝胶电泳后目的条带约处于 800 bp 左右，与预

【参考文献】：
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博士论文
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本文编号：3414450