NeuroD慢病毒载体构建及在大鼠神经干细胞的过表达

发布时间：2017-05-03 06:12

  本文关键词：NeuroD慢病毒载体构建及在大鼠神经干细胞的过表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的:在哺乳动物NeuroD在脑的发育中广泛表达而且是中枢神经系统形成所必须的,尤其是海马和小脑的颗粒细胞产生过程中尤为重要。神经祖细胞和放射状胶质细胞中都无NeuroD表达,而在有丝分裂后期细胞可以检测到其表达,并在变性坏死后期神经系统再生的新生细胞NeuroD的表达量有所增高。本研究即构建NeuroD1慢病毒载体,观察并验证NeuroD1对大鼠神经干细胞的表达活性。方法:利用SD大鼠新生鼠脑cDNA模板,设计合成NeuroD的cds区引物序列,用PCR扩增出目的片段,凝胶回收纯化和双酶切,将NeuroD基因连接在慢病毒表达载体上,并与DH5a细菌同源重组,挑选阳性克隆,小提质粒行基因测序鉴定,大抽质粒后用Lipo2000转染293细胞,包装浓缩得到lv-NeuroD1和Lv-Green重组慢病毒;分离孕13-15 dSD大鼠胚胎脑NSCs,无血清培养基(DMEM/F12,含bFGF、EGF、B27等)条件下培养,免疫细胞化学法鉴定神经干细胞;慢病毒转染SD胎鼠神经干细胞,qPCR法检测NeuroD1的表达情况。结果:在本实验中,经检测我们成功地构建NeuroD1慢病毒表达载体;分离并鉴定了孕14-16天SD大鼠胎鼠脑NSCs,并在体外培养增殖;NeuroD1慢病毒转染神经干细胞后,能在神经干细胞中过量表达。结论:成功构建了大鼠脑源性NeuroD1慢病毒载体,成功转染神经干细胞,为进一步研究NeuroD1在神经干细胞分化中的信号通路和基因工程神经干细胞治疗研究奠定了基础。
【关键词】：NeuroD 慢病毒 载体构建 神经干细胞 过表达
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.28
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-11
• 材料和方法11-30
• 1.实验材料12-15
• 1.1 菌种、细胞株和载体12-13
• 1.2 主要实验试剂和设备13-14
• 1.3 实验试剂的配制14-15
• 2.实验方法15-30
• 2.1 NeuroD慢病毒载体的构建15-21
• 2.2 慢病毒包装21-24
• 2.3 神经干细胞的培养24-26
• 2.4 NeuroD慢病毒转染神经干细胞26-30
• 结果30-40
• 1.慢病毒质粒构建及包装30-34
• 1.1 提取SD新生鼠脑总RNA30
• 1.2 PCR扩增NeuroD目的基因30
• 1.3 双酶切、菌落PCR验证重组质粒和测序鉴定30-34
• 2.慢病毒包装及滴度34-35
• 3.神经干细胞培养及鉴定结果35-40
• 讨论40-43
• 结论43-44
• 参考文献44-51
• 综述51-69
• 参考文献58-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Differentiation of embryonic versus adult rat neural stem cells into dopaminergic neurons in vitro[J];Neural Regeneration Research;2008年08期

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本文编号：342482