重组人HER3胞外域Ⅰ区183-227aa的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定

发布时间：2021-10-11 19:43

　　目的原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3（HER3）183-227aa肽段（HER3Ⅰ）和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段（MVF）融合构建的重组肽（MVF-HER3Ⅰ）,并制备其多克隆抗体。方法将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ,用化学合成法合成重组肽基因,并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白（Trx）基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒,重组质粒用双酶切法鉴定。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）并进行表达参数优化及诱导表达。融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽。表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析。以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体。用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价,免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别,激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7细胞的结合,磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用。结果成功构建了重组肽的两种表达质粒,重组肽基因不能单独表达,但和... 

【文章来源】：南方医科大学学报. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

重组质粒pET21b-MVF-HER3Ⅰ和pET32a-MVF-HER3Ⅰ的双酶切鉴定

随机挑取的多株转化了pET32a-MVF-HER3Ⅰ或PET21b-MVF-HER3Ⅰ的工程菌经IPTG诱导后，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果显示，构建于pET21b的MVF-HER3Ⅰ基因不能单独表达，但和Trx融合后可见明显的蛋白表达条带（图2）。融合蛋白TrxMVF-HER3Ⅰ相对分子质量约为24 000和理论值一致。2.3 Trx-MVF-HER3Ⅰ诱导时间的优化

12%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，工程菌在培养温度为37℃，1 mmol/L IPTG诱导培养7 h时，对TrxMVF-HER3Ⅰ的表达量达峰值，约为20%（图3）。据此确定工程菌在此条件下对Trx-MVF-HER3Ⅰ最优诱导表达时间为7 h。2.4 Trx-MVF-HER3ⅠIPTG诱导浓度的优化

【参考文献】：
期刊论文
[1]奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶多克隆抗体的制备和鉴定[J]. 彭亮,区静怡,潘嘉韵,邓聪,陈景红,曹虹.  南方医科大学学报. 2017(03)



本文编号：3431129