超高压胁迫改变副溶血性弧菌毒力的机理研究

发布时间：2017-05-03 20:12

  本文关键词：超高压胁迫改变副溶血性弧菌毒力的机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文对从胃肠道患者粪便中分离得到的副溶血性弧菌C4株进行鉴定,并进行多轮的超高压处理获得具有耐压遗传特性的耐压株N11。通过溶血实验、生物被膜形成能力和小鼠急性毒性实验、小鼠脏器损伤程度,来比较原始株C4和耐压株N11的体内毒力和体外毒力。以原始株C4和耐压株N11的全基因组DNA为模板,构建C4株的Paired-end library、Mate-pair library文库和N11株的Paired-end library文库,进而采用Illumina高通量测序技术进行测序。对C4株的全基因组序列进行拼接、注释、预测和COG分类,结合N11株的全基因组测序结果进行两者间的比较基因组分析,以筛选N11株内发生的突变碱基。最后,利用实时荧光定量PCR技术考察受突变位点调控的基因和毒力相关基因在C4和N11这两株菌之间的差异表达,以分析超高压胁迫改变副溶血性弧菌毒力的机理,为食品安全以及细菌毒性变化提供生物学依据。具体结论如下：对从胃肠道患者粪便中分离得到的菌株进行生化和基因型的鉴定,确定该菌株为副溶血性弧菌,并命名为C4株。以C4株为研究对象,经过多轮超高压驯化,得到耐压株N11。溶血实验表明C4和N11这两株菌均有微弱的溶血现象,但是无法比较它们的毒力大小。生物被膜形成能力结果显示,C4株的形成能力显著高于N11株。小鼠急性毒性实验表明,N11株的半数致死剂量(LDso)高于C4株；而进一步的小鼠脏器病理学分析结果亦显示N11株对小鼠脏器的损伤程度较低,即超高压处理减弱了副溶血性弧菌的毒力。对高通量测序得到的C4株reads进行组装和拼接,最终得到含有12个scaffolds的全基因组序列,其中CDS、tRNA、rRNA的数量分别为4850、110、11个。基于全基因组蛋白质序列所构建的进化树表明,C4株与副溶血性弧菌的亲缘关系最近,这进一步证实C4株为副溶血性弧菌,以及基因预测的结果也较为理想。COG分类发现C4株内有38%的基因参与了细菌的代谢过程；差异位点分析表明,N11株相对于C4株有4个区域共21个核苷酸发生了突变。对C4株全基因组序列上的毒力相关基因进行鉴定,发现C4株中存在编码TDH-S、TDH-A、TLH的基因,但未发现编码TRH的基因；存在两组编码Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pili,TFP)的基因,分别为角质菌毛(Chitin-regulated pilus,ChiRP)以及甘露醇敏感凝血素IV型菌毛(mannose-sensitive hemagglutinin,MSHA);存在两个ⅢI型分泌系统,分别为TTSS1和TTSS2;未发现编码尿素酶的基因。以培养中的C4和N11株的mRNA为模板,采用实时荧光定量PCR分析毒力基因的相对表达水平,发现编码主要溶血毒素和MSHA的基因在N11株中的表达量显著低于C4株,溶血毒素是副溶血性弧菌中的主要毒力因子,N11株表达量的减少可能是其毒力降低的主要原因。此外,通过实时荧光定量PCR分析了受突变位点调控的上下游基因：C4_4795基因编码生成RNA结合蛋白,发现该基因的mRNA表达水平发生下调,推测这可能会导致N11株毒力的降低；C4 4609基因可翻译成HD-GYP结构域,在N11株中该基因的mRNA表达水平下调,有可能削弱对环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)的降解作用,进而减弱了N11株的运动性和毒力因子的产生,从而降低了耐压株N11的毒力。
【关键词】：副溶血性弧菌 超高压处理 耐压 毒力变化
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 前言13-23
• 1.1 细菌的致病性及其影响因素13-15
• 1.1.1 细菌的致病性13
• 1.1.2 细菌致病性的影响因素13-15
• 1.1.2.1 侵袭力13-14
• 1.1.2.2 细菌毒素14
• 1.1.2.3 细菌侵入的数量14
• 1.1.2.4 细菌侵入机体的途径14-15
• 1.2 副溶血性弧菌的生物学特性及其主要毒力因子15-19
• 1.2.1 生物学特性15-16
• 1.2.2 副溶血弧菌的主要毒力因子16-19
• 1.2.2.1 溶血毒素16-17
• 1.2.2.2 粘附因子17-18
• 1.2.2.3 胞外蛋白酶18
• 1.2.2.4 尿素酶(Ure)18
• 1.2.2.5 Ⅲ型分泌系统18-19
• 1.2.2.6 其他毒力因子19
• 1.3 碱基突变对生物性状的影响19-21
• 1.3.1 碱基突变的诱因19-20
• 1.3.2 碱基突变对生物个体的影响20-21
• 1.4 技术路线、研究内容及意义21-23
• 1.4.1 技术路线21
• 1.4.2 研究内容21-22
• 1.4.2.1 菌株鉴定、筛选及毒力评价21
• 1.4.2.2 基因组测序、分析及差异位点分析21-22
• 1.4.2.3 全基因组中毒力基因分析及其与突变位点相关基因的差异表达分析22
• 1.4.3 研究意义22-23
• 第2章 菌株鉴定、筛选及毒力评价23-41
• 2.1 引言23
• 2.2 材料与仪器23-24
• 2.2.1 菌种与材料23-24
• 2.2.2 仪器与设备24
• 2.3 实验方法24-30
• 2.3.1 菌株的分离与培养24-25
• 2.3.2 生化鉴定25
• 2.3.3 细菌总DNA的提取及PCR验证25-26
• 2.3.4 系统发育树的构建及在线比对26
• 2.3.5 生长曲线的绘制26-27
• 2.3.6 耐压菌株的筛选27
• 2.3.7 菌株体外毒力测定27-28
• 2.3.7.1 溶血性测定27
• 2.3.7.2 生物被膜形成能力测定27-28
• 2.3.8 菌株体内毒力测定28-30
• 2.3.8.1 小鼠急性毒性实验28-29
• 2.3.8.2 小鼠肝脏与脾脏组织切片和HE染色29-30
• 2.4 结果与讨论30-39
• 2.4.1 生化鉴定结果30-31
• 2.4.2 基因型鉴定结果31-34
• 2.4.3 耐压菌株的筛选结果及菌株的生长曲线34-35
• 2.4.4 菌株体外毒力测定结果35-36
• 2.4.4.1 溶血性测定结果35-36
• 2.4.4.2 生物被膜形成能力的比较36
• 2.4.5 菌株体内毒力测定结果36-39
• 2.4.5.1 小鼠急性毒性实验36-37
• 2.4.5.2 病理组织学变化37-39
• 2.5 本章小结39-41
• 第3章 基因组测序及分析41-56
• 3.1 引言41
• 3.2 材料与仪器41-42
• 3.2.1 菌株与材料41
• 3.2.2 仪器与设备41-42
• 3.3 实验方法42-45
• 3.3.1 基因组DNA的提取及检测42
• 3.3.2 基因组测序和预处理42
• 3.3.3 基因组拼接、预测和注释42-43
• 3.3.4 构建全基因组的系统发育树43-44
• 3.3.5 COG分类44
• 3.3.6 两株菌全基因组差异位点分析44-45
• 3.4 结果与讨论45-55
• 3.4.1 DNA样品质量检测结果45-46
• 3.4.2 reads质量满足基因组分析46-48
• 3.4.3 基因组拼接结果和预测48-50
• 3.4.4 C4菌株的进化分析50-51
• 3.4.5 基因的COG分类51-53
• 3.4.6 非编码区基因位点发生突变53-55
• 3.5 本章总结55-56
• 第4章 毒力基因及突变位点相关基因的差异表达分析56-68
• 4.1 引言56
• 4.2 材料与仪器56-57
• 4.2.1 实验材料56-57
• 4.2.2 仪器与设备57
• 4.3 实验方法57-60
• 4.3.1 基因组中毒力相关基因分析57
• 4.3.2 全基因组RNA的提取57
• 4.3.3 RNA中基因组DNA的去除57-58
• 4.3.4 cDNA的合成58
• 4.3.5 实时荧光定量PCR58-60
• 4.4 结果与讨论60-67
• 4.4.1 菌株中毒力相关基因的分布60-64
• 4.4.2 主要毒力因子的差异表达64-65
• 4.4.3 突变位点邻近基因的差异表达65-67
• 4.5 本章总结67-68
• 第5章 结论、创新点与展望68-71
• 5.1 结论68-69
• 5.2 创新点69
• 5.3 展望69-71
• 参考文献71-77
• 硕士期间发表的论文77-78
• 致谢78-79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李志峰,戴迎春;副溶血弧菌的溶血毒素研究现况[J];解放军预防医学杂志;2003年01期

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本文编号：343673