衣原体质粒侵袭细胞相关毒力基因的体外鉴定

发布时间：2017-05-04 00:07

  本文关键词：衣原体质粒侵袭细胞相关毒力基因的体外鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:体外培养、扩增和纯化沙眼衣原体鼠肺炎株(MoPn)。比较几种转化MoPn菌株在体外培养中对宿主细胞的感染力,鉴定与衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因,并比较不同实验条件对衣原体侵袭和粘附宿主细胞能力的影响;鉴定影响衣原体在宿主细胞与细胞间传播和生长能力和导致包涵体内糖原合成障碍相关的基因。方法:选取Hela细胞为宿主细胞,将携带敲除了衣原体质粒中不同开放阅读框(ORF)的各转化菌株接种培养20~24h,复苏成功后不断扩增收集。采用泛影钠-泛影葡胺密度梯度离心法进行菌株的纯化;测定各菌株浓度,按相同的菌量接种,设定离心+二乙胺乙基葡聚糖(DEAE-D)、离心、DEAE-D、无任何处理四个接种条件,在不同的实验条件下分别对各菌株进行处理,利用间接免疫荧光显微镜计数包涵体数目;分别于(20、40、60 h)观察各菌株连续3代感染细胞后菌斑形成的速度与面积大小;采用Lugol碘液染色,在倒置显微镜下,观察各菌株包涵体内糖原的合成情况。结果:纯化后获得了高感染活性的沙眼衣原体原体(EB)。敲除质粒编码蛋白Pgp4的菌株p GFP::CMΔPgp4在4种条件下包涵体数目分别为(10.20±1.30)、(6.80±0.44)、(3.00±1.22)和(0.80±0.45)个,阴性对照组质粒缺失株CMUT3包涵体数目分别为(6.40±0.89)、(3.80±0.83)、(1.60±0.89)和(0.60±0.54)个,同一条件下两者均表现出相近的感染能力,包涵体数目均低于同一条件下其他菌株(均P0.01);同一菌株在不同条件下,包涵体数目差异具有统计学意义(F=845.310,P0.01);各菌株在离心+DEAE-D条件下包涵体数目最多;菌株p GFP::CMΔPgp4和质粒缺失株连续3代感染细胞时菌斑形成的速度和面积大小均低于其他菌株;并出现糖原累积的障碍。结论:超速低温密度梯度离心纯化能够去除细胞中其它细胞成分对实验结果的影响,较既往常规的纯化方法更能保证结果的可靠性。Pgp4是衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因之一,影响衣原体在宿主细胞与细胞之间的传播和生长能力和包涵体内糖原的合成能力。实验条件离心和DEAE-D均能增强毒力基因在体外对宿主细胞的侵袭和粘附能力。
【关键词】：沙眼衣原体 纯化 质粒 开放阅读框 毒力基因
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R374
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 缩略语/符号说明9-10
• 前言10-15
• 研究现状、成果10-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、沙眼衣原体鼠肺炎株扩增与纯化方法的建立15-29
• 1.1 对象和方法15-22
• 1.1.1 材料15-17
• 1.1.2 方法17-22
• 1.2 结果22-25
• 1.2.1 HeLa细胞培养22-23
• 1.2.2 C.t间接免疫荧光检测复苏结果23-24
• 1.2.3 间接免疫荧光检测纯化结果24-25
• 1.3 讨论25-28
• 1.3.1 沙眼衣原体鼠肺炎株培养用单层细胞制备25-26
• 1.3.2 沙眼衣原体鼠肺炎株的检测26
• 1.3.3 体外纯化实验讨论26-28
• 1.4 小结28-29
• 二、体外鉴定与衣原体质粒侵袭细胞相关的毒力基因29-39
• 2.1 材料和方法29-31
• 2.1.1 材料29
• 2.1.2 方法29-31
• 2.1.3 统计学方法31
• 2.2 结果31-35
• 2.2.1 各菌株浓度测定的结果31-32
• 2.2.2 体外检测各菌株感染能力32-33
• 2.2.3 各菌株菌斑形成能力检测33-34
• 2.2.4 各菌株糖原合成能力检测碘染色34-35
• 2.3 讨论35-38
• 2.3.1 沙眼衣原体体外实验结果讨论35-37
• 2.3.2 沙眼衣原体体外实验意义37-38
• 2.4 小结38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-47
• 发表论文和参加科研情况说明47-48
• 综述 沙眼衣原体质粒研究进展48-62
• 综述参考文献55-62
• 致谢62

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李保安;范久波;刘海菊;刘开琴;程瑾;李智山;;金标数码定量阅读仪QPAD的性能验证[J];国际检验医学杂志;2014年02期

2 高磊琼;张燕;华子瑜;沈犁;;沙眼衣原体隐匿质粒编码蛋白的表达及其相互作用[J];第三军医大学学报;2015年01期

3 肖萌;刘全忠;齐蔓莉;;沙眼衣原体免疫优势蛋白的研究进展[J];中国麻风皮肤病杂志;2013年06期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 王则宇;α-甘露糖苷酶活性在沙眼衣原体侵染细胞中的作用及其诊断价值的研究[D];郑州大学;2014年

2 潘青;猪流产衣原体Pmp18N-rVCG疫苗的构建、小鼠免疫评价和机制研究[D];中国农业大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 肖萌;泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体的检测[D];天津医科大学;2014年

  本文关键词：衣原体质粒侵袭细胞相关毒力基因的体外鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：344018