轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

发布时间：2017-05-04 03:10

  本文关键词：轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：轮状病毒(RV)能够引起人类、哺乳动物类、禽类腹泻,其中A组RV是引起婴幼儿急性胃肠炎的主要病原体。完整的RV共有三层衣壳,其基因组包裹在同心衣壳蛋白组成的二十面体颗粒中,由11个分节段的双链RNA组成。RVVP6蛋白位于病毒的中间层衣壳,既是病毒含量中最丰富的蛋白,也是RV的组抗原蛋白。VP6蛋白氨基酸序列具有高度保守性,并具有较强的抗原交叉反应性：RV VP4和VP7是主要的中和抗体原蛋白。VP4蛋白在病毒外壳形成刺突样结构,能独立诱导机体产生中和抗体。目前上市的RV疫苗均为减毒活疫苗,这些疫苗虽有其优势,也有一定潜在的不足,开发安全有效的新型疫苗仍具有重要意义。本研究选取VP4蛋白上具有高度保守性和抗原交叉反应性的第296-313位和第381-401位氨基酸抗原表位进行重组抗原表位嵌合蛋白研究。采用基因工程技术,成功构建A组人RV TB-Chen株VP6载体蛋白,将上述两个抗原表位分别插入VP6蛋白载体基因同一位点,构建重组表达质粒,在大肠杆菌(E.coli)细胞中成功表达出两个在VP6载体蛋白表面携带有VP4中和抗原表位的重组嵌合蛋白。表达的嵌合蛋白可与相应抗体发生特异性反应；可诱导豚鼠产生特异性血清抗体；抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F, Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性。结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性；嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用。本研究为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定较好基础。
【关键词】：轮状病毒 VP4抗原表位 VP6蛋白载体 重组嵌合蛋白 免疫原性
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 前言8-14
• 实验材料和方法14-31
• 一、实验材料14-16
• 1. 主要仪器14-15
• 2. 主要试剂15
• 3. 菌毒株,载体质粒,细胞和实验动物15-16
• 二.实验方法16-31
• 1. 构建pETP6重组质粒并鉴定16-21
• 1.1 合成引物16-17
• 1.2 TB-Chen株RV VP6全编码基因组的PCR扩增17
• 1.3 回收PCR扩增产物17
• 1.4 制备连接片段并进行连接和转化17-19
• 1.4.1 连接片段的制备17-18
• 1.4.2 VP6基因与pETL载体酶切片断连接18
• 1.4.3 连接反应产物转化DH5α感受态细胞18-19
• 1.5 重组表达质粒pETP6的制备及鉴定19-21
• 1.5.1 碱裂解法小量制备质粒DNA19
• 1.5.2 Nde Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定重组表达质粒19
• 1.5.3 大量制备质粒DNA19-20
• 1.5.4 核苷酸序列测定20-21
• 2 pETP6v载体质粒的构建及鉴定21-24
• 2.1 携带Sac Ⅱ酶切位点的载体质粒制备及鉴定21-24
• 2.1.1 携带Sac Ⅱ酶切位点的插入片段的制备21-22
• 2.1.2 载体片段制备22
• 2.1.3 插入片段与载体质粒酶切片段的连接22-23
• 2.1.4 连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞23
• 2.1.5 碱裂解法小量制备质粒DNA23
• 2.1.6 酶切鉴定重组表达质粒pETP6v(Sac Ⅱ)23
• 2.1.7 大量制备质粒DNA23
• 2.1.8 核苷酸序列测定23-24
• 3. 含有VP6蛋白基因不同位置上带有不同酶切位点的pETP6v载体质粒的构建24
• 4. 携带RV VP4抗原表位重组表达质粒pETP6F298S/P[8]296和pETP6F298S/P[8]381的构建及鉴定24-26
• 4.1 外源抗原表位(P[8]296,P[8]381)的设计24-25
• 4.2 引物互补片段的制备25
• 4.3 载体质粒pETP6F酶切片段的制备25
• 4.4 插入片段和载体质粒pETP6v酶切片段的连接及转化25-26
• 4.5 连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞26
• 4.6 碱裂解法小量制备质粒DNA26
• 4.7 酶切鉴定重组表达质粒26
• 4.8 大量制备质粒DNA26
• 4.9 核苷酸序列测定26
• 5. 重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F/P[8]296,6F/P[8]381在大肠杆菌中的表达26-27
• 6. 重组载体蛋白(rVP6v)和重组嵌合蛋白的纯化27
• 7. Bradford法测定纯化蛋白的浓度27-28
• 8. MA104细胞复苏与传代培养28
• 8.1 MA104细胞的复苏28
• 8.2 MA104细胞的传代培养28
• 9. RV增殖,收获28-29
• 10. RV的纯化29
• 11. 动物免疫及血清抗体的制备29-30
• 11.1 实验动物分组29
• 11.2 免疫方案29-30
• 12. 微量滴定法测Wa病毒感染性滴度30
• 13. 重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381免疫豚鼠血清中和抗体效价的检测30
• 14. Western blot检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性30-31
• 结果与分析31-38
• 1 质粒的构建31-33
• 1.1 VP6基因的扩增31-32
• 1.2 携带RV VP6基因的重组表达质粒pETP6的构建及鉴定32
• 1.3 携带外源抗原表位的重组表达质粒pETP6F298S/P[8]/296和pETP6F298S/P[8]/381的构建及鉴定32-33
• 2 重组嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表达和纯化33-34
• 3 纯化蛋白浓度的测定34-35
• 4 RV病毒感染性滴度的测定和免疫动物血清中和抗体滴度测定35-36
• 5 Western blot分析36-38
• 讨论38-41
• 小结41-42
• 参考文献42-46
• 附录46-65
• (一) 缩略词46-47
• (二) 主要溶液配方47-55
• (三) 主要实验步骤55-63
• (四) RVTB-CHEN株VP6编码基因核苷酸序列及氨基酸序列63-65
• 致谢65-66
• 研究生简历66-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 汤晶晶;韩新民;;小儿轮状病毒肠炎研究进展[J];辽宁中医药大学学报;2013年04期

2 张艳;文喻玲;魏海涛;李传印;范耀春;陈元鼎;;A组轮状病毒VP5~*和VP8~*的表达和免疫学性质研究(英文)[J];中国生物工程杂志;2010年02期

3 潘小霞;张顺;陈元鼎;;轮状病毒VP_6蛋白免疫学研究进展[J];中国疫苗和免疫;2011年02期

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本文编号：344284