两个新型结核杆菌DNA甲基化酶的鉴定和性质初步分析

发布时间：2017-05-05 09:00

  本文关键词：两个新型结核杆菌DNA甲基化酶的鉴定和性质初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：DNA甲基化是DNA表观修饰的普遍形式,它几乎存在于所有生命体中,包括细菌。DNA甲基化修饰主要是由DNA甲基化转移酶介导的,在腺嘌呤或胞嘧啶上转移一个甲基的过程。在细菌中,DNA甲基化酶通常与同源的限制性内切酶一起组成限制-修饰(R-M)系统,对细菌起防御保护功能。同时在许多基因组中也发现了孤儿甲基化酶,它们对基因的表达起调节作用。本文通过应用三代单分子实时测序(SMRT)技术,对牛结核分枝杆菌无毒株卡介苗BCG进行测序分析,首次报道了BCG菌株单碱基分辨水平的DNA甲基化组,包含3种DNA甲基化motif位点,均为m6A修饰。这3种甲基化motif的甲基化程度有所差异,其中CACGCAG和CTCCAG的甲基化程度达到99%以上,但GATN4RTAC的甲基化比例仅为77%,而且该motif与其他两种motif相比较,倾向于分布在基因间区及启动子区。除了已报道的MamA DNA甲基化酶,本文又验证了2个新型的DNA甲基化酶,分别是HsdM甲基化酶和MamB甲基化酶。我们通过重组表达、蛋白纯化、基因敲除、重组质粒酶切及三代测序等体外实验技术对这两个新型DNA甲基化酶进行了性质研究。结果表明：1) HsdM是典型的Ⅰ型DNA甲基化酶,其甲基化位点是GATN4RTAC对第二个A进行m6A修饰,产生双链甲基化。敲除突变体的实验表明,HsdS2亚基是HsdM DNA甲基化酶的必需亚基,而HsdS1亚基是非必需的；2) MamB是一个ⅡG型融合DNA甲基化酶,其识别位点是CACGCAG,对第6个A进行m6A修饰,产生单链甲基化。本研究首次对结核杆菌复合群代表性菌株——BCG的DNA甲基化组及其DNA甲基化转移酶进行了深入分析,为结核病表观修饰的分子机制研究奠定基础。
【关键词】：DNA甲基化 单分子实时测序技术 DNA甲基化转移酶
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 专业词汇中英文对照表9-13
• 第1章 引言13-29
• 1.1 结核杆菌的研究概况13-14
• 1.2 DNA甲基化修饰14-17
• 1.3 原核生物中甲基化转移酶的概况17-18
• 1.4 细菌中的R-M系统18-23
• 1.5 结核甲基化研究进展23-24
• 1.6 DNA甲基化修饰的检测方法24-27
• 1.6.1 重亚硫酸盐测序法24
• 1.6.2 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法24-25
• 1.6.3 焦磷酸测序25
• 1.6.4 芯片技术25
• 1.6.5 荧光定量法25
• 1.6.6 质谱检测技术25
• 1.6.7 三代单分子实时测序(SMRT)技术25-27
• 1.7 本课题的研究目的及意义27-29
• 第2章 实验材料和方法29-47
• 2.1 实验材料29-32
• 2.1.1 实验菌株29
• 2.1.2 质粒29
• 2.1.3 工具酶29-30
• 2.1.4 试剂(盒)及配制30-31
• 2.1.5 溶菌酶溶液的配制31
• 2.1.6 LB培养基的配制31
• 2.1.7 结核菌培养基的配制31
• 2.1.8 SDS-PAGE凝胶配制31-32
• 2.2 引物序列32-33
• 2.3 仪器与耗材33-34
• 2.4 实验方法34-47
• 2.4.1 牛结核杆菌卡介苗BCG的培养34
• 2.4.2 BCG基因组DNA提取34
• 2.4.3 三代单分子实时测序(SMRT)技术34
• 2.4.4 三代测序数据分析34-35
• 2.4.5 大肠杆菌感受态细胞的制备35
• 2.4.6 重组质粒的转化35-36
• 2.4.7 DNA胶回收实验36
• 2.4.8 HsdM甲基化酶识别位点的鉴定36-39
• 2.4.9 通过HsdM敲除突变体鉴定甲基化酶亚基的活性39-41
• 2.4.10 MamB甲基化酶识别位点的鉴定41-43
• 2.4.11 MamB甲基化酶的内切酶功能鉴定43-47
• 第3章 三代单分子实时测序(SMRT)技术检测卡介苗BCG甲基化组47-53
• 3.1 背景介绍47-48
• 3.2 实验结果和分析48-51
• 3.2.1 基因组拼接与注释48-49
• 3.2.2 DNA甲基化的分布49-50
• 3.2.3 DNA甲基化酶的预测50-51
• 3.3 小结及讨论51-53
• 第4章 DNA甲基化酶HsdM的鉴定及性质研究53-65
• 4.1 背景介绍53
• 4.2 实验结果和分析53-61
• 4.2.1 实验设计思路54-55
• 4.2.2 Ⅰ型HsdM甲基化转移酶识别motif的鉴定55-57
• 4.2.3 敲除突变体S2MS1的DNA甲基化酶活性鉴定57-58
• 4.2.4 敲除突变体S2M的DNA甲基化酶活性鉴定58-60
• 4.2.5 敲除突变体MS1的DNA甲基化酶活性鉴定60-61
• 4.3 小结和讨论61-65
• 第5章 DNA甲基化酶MamB的鉴定及性质研究65-71
• 5.1 背景介绍65
• 5.2 实验结果和分析65-70
• 5.2.1 MamB甲基化转移酶识别motif的鉴定65-68
• 5.2.2 MamB蛋白的表达与纯化68-70
• 5.3 小结和讨论70-71
• 第6章 总结与展望71-73
• 参考文献73-83
• 附录 DNA甲基化酶核苷酸序列83-91
• 个人简历91

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