瑞香素联合DC疫苗抗小鼠移植性肿瘤H22效应的实验研究

发布时间：2017-05-05 13:10

  本文关键词：瑞香素联合DC疫苗抗小鼠移植性肿瘤H22效应的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察瑞香素联合树突状细胞(DC)疫苗对小鼠H22肝癌移植瘤抗肿瘤免疫效应及其对荷瘤小鼠肿瘤细胞中抑凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax mRNA表达的影响,初步探讨瑞香素联合DC疫苗抗肿瘤的可能机制。方法:1、采用MTT法检测不同浓度瑞香素对人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌H22体外增殖的抑制作用;2、体外培养DC并在倒置显微镜下观察细胞形态,应用反复冻融法制备的肿瘤细胞全细胞抗原冲击DC制备DC肿瘤疫苗;3、瑞香素联合DC疫苗的体内抑瘤作用:建立小鼠H22肝癌荷瘤模型,将实验动物随机分为荷瘤对照组、5-Fu治疗组、瑞香素组、DC疫苗组、瑞香素联合DC疫苗组,另设健康对照组,每组8只,健康对照组和荷瘤对照组每鼠每天腹腔注射生理盐水0.2mL,共14天;5-Fu组按20mg/kg·d剂量每鼠每天腹腔注射0.2mL,共14天;瑞香素组按4mg/kg·d剂量每鼠每天腹腔注射瑞香素0.2mL,共14天;DC疫苗组于接种肿瘤细胞后的第1d、7d在接种部位瘤周皮下注射DC疫苗(5×106/只);瑞香素联合DC疫苗组:瑞香素按4mg/kg·d剂量每鼠每天腹腔注射瑞香素0.2mL,同时于接种肿瘤细胞后的第1d、7d在接种部位瘤周皮下注射DC疫苗(5×106/只)。第15天处死治疗小鼠,计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数;4、检测小鼠NK细胞活性以及ConA诱导的脾T淋巴细胞增殖指数(MTT法);5、HE染色,光镜下观察H22肝癌组织病理学改变;6、ELISA法检测各组小鼠血清中细胞因子IFN-γ、ΙL-12、ΙL-4的水平;7、RT-qPCR法检测各组小鼠肿瘤组织Bcl-2、Bax mRNA的表达。结果:1、①瑞香素浓度(μg/mL)为250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.97、0.48时,作用hepg2细胞48h,其抑制率(%)分别为:63.71±2.20、62.69±0.76、61.68±1.80、59.09±1.08、56.40±1.33、47.92±1.65和28.02±2.23、20.05±1.60、16.60±1.53、10.10±1.71,ic50值(μg/ml)为21.89±0.70。②瑞香素浓度(μg/ml)为250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、1.95、0.97、0.48时,作用于h22细胞48h,其抑制率(%)分别为:85.52±5.15、65.04±4.72、61.04±5.94、50.77±7.40、47.26±8.49、45.21±6.37、36.52±3.53、33.55±8.26、23.62±8.67、19.79±5.47,ic50值(μg/ml)为16.89±9.64。2、各用药组对小鼠移植瘤生长均有抑制作用,以5-fu组最为明显。荷瘤对照组、5-fu组、瑞香素组、dc疫苗组、瑞香素联合dc疫苗组瘤质量(g)分别为1.817±0.388、0.424±0.309、0.833±0.314、1.206±0.523和0.493±0.306,均低于荷瘤对照组(p0.05)。三治疗组间两两相比,差异有统计学意义(p0.05),联合治疗组与5-fu相比,差异无统计学意义(p0.05)。3、①瑞香素组、dc疫苗组、瑞香素联合dc疫苗组脾脏指数分别是8.504±0.508、10.878±3.916和12.902±2.927,均高于荷瘤对照组7.075±0.379(p0.05)。联合治疗组高于与瑞香素组、dc疫苗组(p0.05),但瑞香素组与dc疫苗组间无差异(p0.05)。5-fu组脾脏指数为5.638±1.567,低于荷瘤对照组(p0.05)。②三治疗组胸腺指数虽略高于荷瘤对照组,但差异无统计学意义(p0.05)。而5-fu组胸腺指数低于荷瘤对照组和健康对照组,差异有统计学意义(p0.05)。4、瑞香素组、瑞香素联合dc疫苗组nk细胞活性高于荷瘤对照组和5-fu组(p0.05),其中瑞香素联合dc疫苗组的最高为(64.40±9.99)%,其次为瑞香素组(59.50±10.90)%。5-fu组则大大降低了脾淋巴细胞杀瘤活性,低于健康对照组和荷瘤对照组(p0.05)。5、瑞香素组、瑞香素联合dc疫苗组cona诱导的t淋巴细胞增殖刺激指数高于荷瘤对照组和5-fu组(p0.05);5-fu组cona诱导的t淋巴细胞增殖刺激指数,低于荷瘤对照组和健康对照组(p0.05)。6、各组肿瘤组织的病理学变化:he染色显示,瑞香素联合dc疫苗组可见大面积坏死区,较多肿瘤细胞呈细胞核碎裂,核固缩等凋亡和坏死的形态学改变;荷瘤对照组坏死区较少,且坏死面积较小,肿瘤细胞生长旺盛,坏死及凋亡细胞较少;瑞香素组和dc疫苗组亦有明显坏死,但坏死程度较瑞香素联合dc疫苗组明显减轻。7、治疗组小鼠外周血细胞因子检测:①三治疗组血清IL-12含量均较荷瘤对照组高(P0.05),其中,瑞香素联合DC疫苗组瑞香素组DC疫苗组(P0.05)。②三治疗组血清IFN-γ含量均高于荷瘤对照组和5-Fu组,其中瑞香素联合DC疫苗组高于瑞香素组和DC疫苗组(P0.05),但瑞香素组和DC疫苗组相比差异无显著性(P0.05),瑞香素联合DC疫苗组也高于健康对照组(P0.05)。③三治疗组血清IL-4含量均低于荷瘤对照组(P0.05),其中瑞香素联合DC疫苗组又低于瑞香素组和DC疫苗组(P0.05),瑞香素组和DC疫苗组相比,差异无统计学意义(P0.05)。8、RT-qPCR实验结果显示,瑞香素组、DC疫苗组、瑞香素联合DC疫苗组均能下调瘤组织中Bcl-2 mRNA的表达,同时能上调瘤组织中Bax mRNA的表达,与荷瘤对照组相比,差异有统计学意义(P0.05);其中瑞香素联合DC疫苗组瘤组织Bcl-2 mRNA与Bax mRNA比值最小。结论:1、瑞香素对HepG2细胞生长有不同程度的抑制作用,在0.48~250μg/mL浓度范围内呈现良好的剂量依赖性;瑞香素对H22细胞生长也有抑制作用,在0.48~250μg/mL浓度范围内亦呈现良好的剂量依赖性;2、瑞香素联合DC疫苗能够改善荷瘤小鼠的免疫功能状态,对小鼠H22移植瘤具有抑瘤作用,且效果好于单独使用瑞香素或DC疫苗。
【关键词】：瑞香素 DC疫苗 H22 免疫功能 Bcl-2 Bax 细胞因子
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩略词表12-13
• 第1章 前言13-16
• 第2章 材料与方法16-30
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 肿瘤细胞株16
• 2.1.2 实验动物16
• 2.1.3 试验药物16
• 2.1.4 主要试剂16-17
• 2.1.5 主要试剂配制17-18
• 2.1.6 主要仪器设备18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 MTT法检测瑞香素对HepG2细胞增殖抑制18-20
• 2.2.2 MTT法检测瑞香素对H22细胞增殖抑制20-21
• 2.2.3 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠体内抑瘤作用及免疫功能影响21-24
• 2.2.4 HE染色法观察肿瘤组织病理学变化24-25
• 2.2.5 ELISA法检测各组小鼠外周血血清IFN25-27
• 2.2.6 RT-qPCR法检测各组小鼠瘤组织中Bcl-2、Bax mRNA表达27-29
• 2.3 统计学分析29-30
• 第3章 结果30-45
• 3.1 瑞香素体外抑瘤作用30-31
• 3.1.1 瑞香素对HepG2细胞增殖抑制作用30
• 3.1.2 瑞香素对H22细胞增殖抑制作用30-31
• 3.2 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠体内抑瘤作用及免疫功能影响31-37
• 3.2.1 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠的体内抑瘤作用31-32
• 3.2.2 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响32-35
• 3.2.3 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠NK细胞活性的影响35-36
• 3.2.4 ConA诱导的H22荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖刺激指数36-37
• 3.2.5 HE染色法观察肿瘤组织病理学变化37
• 3.3 各组小鼠外周血中细胞因子 IFN-γ、L-12、L-4 含量37-41
• 3.4 各组小鼠肿瘤组织中 Bcl-2、Bax m RNA 的表达41-45
• 3.4.1 实时荧光定量RT-qPCR的Bcl-2、Bax和 β-actin mRNA扩增产物的熔解曲线41-42
• 3.4.2 实时荧光定量RT-qPCR的Bcl-2、Bax和 β-actin mRNA的扩增曲线42
• 3.4.3 瑞香素联合DC疫苗对荷H22小鼠瘤组织中Bcl-2 和Bax mRNA表达的影响42-45
• 第4章 讨论45-54
• 4.1 瑞香素体外抑瘤作用45-46
• 4.2 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠的体内抑瘤作用及免疫功能影响46-49
• 4.2.1 瑞香素联合DC疫苗对荷H22瘤小鼠体内抑瘤作用46-47
• 4.2.2 瑞香素联合DC疫苗对荷H22小鼠免疫功能的影响47-49
• 4.3 瑞香素联合 DC 疫苗对 H22 荷瘤小鼠外周血中细胞因子 IFN-γ、ΙL-12 和 IL-4 的影响49-51
• 4.4 瑞香素联合DC疫苗对H22荷瘤小鼠瘤组织中Bcl-2、Bax mRNA表达的影响51-54
• 第5章 结论与展望54-55
• 5.1 结论54
• 5.2 进一步研究探索的方向54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-63
• 附图63-67
• 综述67-75
• 参考文献72-75

【参考文献】

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本文编号：346407