Notch、mTOR交互对话促进胸腺上皮细胞衰老的机制研究

发布时间：2021-11-08 12:23

　　目的:以小鼠胸腺上皮细胞系mTEC1（mouse thymic epithelial cell line 1,mTEC1）为研究对象,探讨Notch信号、mTOR信号在胸腺退化和衰老中的作用和机制,为进一步阐明胸腺衰老和退化的机制,预防和治疗胸腺退化引起的T细胞免疫缺陷奠定基础。方法:1.采用GM-CSF+IL-4诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）,并以LPS活化BMDCs,检测其表面Jagged1表达水平。将活化的BMDCs与mTEC1进行共培养和Transwell培养,以β-半乳糖苷酶染色,western blot检测p21等细胞衰老相关指标观察mTEC1衰老情况。2.用重组Jagged1蛋白替代活化的BMDCs与mTEC1细胞共培养,并采用Notch抑制剂DAPT处理与重组Jagged1蛋白共培养的mTEC1;或将Notch3胞内活化片段NICD3慢病毒载体转染mTEC1,以β-半乳糖苷酶染色,western blot检测p21等细胞衰老相关指标,观察Jagged1/Notch信号活化诱导mTEC1衰... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
    1.1 胸腺
        1.1.1 胸腺上皮细胞与T细胞的发育
        1.1.2 胸腺退化
    1.2 Notch信号通路
        1.2.1 Notch的受体和配体
        1.2.2 Notch的受体和配体在胸腺组织细胞中的分布
        1.2.3 Notch信号通路的激活
    1.3 mTOR信号通路
        1.3.1 mTORC1信号通路
        1.3.2 mTORC2信号通路
    1.4 Notch与mTOR信号途径的相互关系
第二章 研究目的、内容、方法、实验设计和意义
    2.1 研究目的
    2.2 研究内容
    2.3 研究方法
    2.4 实验设计方案
        2.4.1 验证活化BMDCs诱导胸腺上皮细胞系m TEC1衰老
        2.4.2 体外验证重组Jagged1蛋白诱导小鼠胸腺上皮细胞系m TEC1衰老
        2.4.3 活化或抑制mTOR信号观察胸腺上皮细胞系m TEC1中Notch信号、Foxn1以及其他衰老标志物变化情况
        2.4.4 活化或抑制Notch信号观察胸腺上皮细胞系m TEC1中mTOR信号、Foxn1以及其他衰老标志物变化情况
    2.5 研究意义
第三章 实验材料和方法
    3.1 试剂与耗材
        3.1.1 试剂
        3.1.2 主要仪器和耗材
        3.1.3 主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
            3.2.1.1 胸腺上皮细胞系m TEC1的培养
            3.2.1.2 人源胚胎肾细胞HEK-293T细胞的培养
        3.2.2 小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）的诱导
            3.2.2.1 小鼠骨髓细胞的获取
            3.2.2.2 小鼠BMDCs的体外诱导
            3.2.2.3 流式细胞术检测BMDCs的活化后表面标志的改变
        3.2.3 β-半乳糖苷酶染色
        3.2.4 免疫荧光染色分析m TEC1表面标志
        3.2.5 Western blot检测不同处理的m TEC1衰老相关蛋白表达
            3.2.5.1 细胞总蛋白的提取
            3.2.5.2 BCA调整蛋白浓度
            3.2.5.3 Western blot
        3.2.6 小鼠Raptor-sh RNA慢病毒载体的构建、包装、感染和鉴定
            3.2.6.1 DH5α 感受态细胞的制备
            3.2.6.2 Raptor-sh RNA慢病毒载体的构建、包装、感染和鉴定
        3.2.7 Rictor-sh RNA慢病毒载体的构建、包装、感染和鉴定
        3.2.8 NICD3慢病毒表达载体扩增、转染、包装和感染
        3.2.9 Notch信号与m TEC1衰老相关性研究
            3.2.9.1 活化的BMDCs诱导m TEC1衰老
            3.2.9.2 重组蛋白Jagged1蛋白诱导m TEC1衰老
            3.2.9.3 NICD3慢病毒感染诱导m TEC1的衰老
            3.2.9.4 Notch抑制剂DAPT抑制Jagged1诱导的m TEC1的衰老
        3.2.10 Notch信号与mTOR交互对话对m TEC1衰老的影响
            3.2.10.1 Rapamycin抑制mTOR信号对Jagged1诱导m TEC1衰老的调节
            3.2.10.2 Sh RNA敲降TSC2基因激活mTORC对Jagged1诱导m TEC1衰老的调节
            3.2.10.3 Sh RNA敲降Raptor基因抑制mTORC1对Jagged1诱导m TEC1衰老的调节
            3.2.10.4 Sh RNA敲降Rictor基因抑制mTORC2对Jagged1诱导m TEC1衰老的调节
            3.2.10.5 转染NICD3激活Notch信号对mTORC1信号及m TEC1衰老的影响
            3.2.10.6 DAPT抑制Notch信号对mTORC1信号及m TEC1衰老的影响
    3.3 统计学分析
第四章 实验结果及讨论
    4.1 Notch信号途径活化诱导m TEC1衰老
        4.1.1 活化的BMDCs上调表达Jagged1及成熟标志
        4.1.2 活化的BMDCs通过直接接触诱导m TEC1衰老
        4.1.3 活化的BMDCs间接接触（Transwell）不能诱导m TEC1衰老
        4.1.4 重组Jagged1蛋白诱导m TEC1的衰老
        4.1.5 NICD3慢病毒感染诱导m TEC1的衰老
        4.1.6 Notch抑制剂DAPT抑制Jagged1诱导的m TEC1的衰老
    4.2 mTORC1与Notch信号交互对话促进m TEC1衰老
        4.2.1 Rapamycin抑制mTOR信号部分逆转Jagged1诱导的m TEC1衰老
        4.2.2 Sh RNA敲降TSC2基因，mTOR信号高度活化，促进Jagged1诱导的m TEC1衰老
        4.2.3 Sh RNA敲降Raptor基因，抑制mTORC1，部分逆转Jagged1诱导的m TEC1衰老
        4.2.4 mTORC2不参与Jagged1/Notch诱导的m TEC1的衰老
        4.2.5 转染NICD3，活化Notch信号，上调mTOR信号，促进m TEC1的衰老
        4.2.6 DAPT阻断Notch信号，负向调控mTOR，抑制Jagged1诱导的m TEC1衰老
    4.3 讨论
第五章 结论与展望
    5.1 主要结论
    5.2 展望
参考文献
文献综述 mTOR信号通路与免疫细胞及自身免疫病
    1.mTOR信号通路的组成与活化
    2.mTOR与树突状细胞（DCs）
    3.mTOR与T细胞
    4.mTOR与自身免疫性疾病
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的文章及参加的会议



本文编号：3483686