Hmox1调控BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨及成脂分化
发布时间：2021-11-22 08:05
目的:研究血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,Hmox1）对骨形态发生蛋白9（Bone Morphogenetic Protein 9,BMP9）诱导的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）C3H10T1/2向成骨及成脂双向分化的影响及可能机制。方法:腺病毒Ad-BMP9感染C3H10T1/2,荧光定量PCR（q PCR）检测Hmox家族中Hmox1的基因表达变化,再用Western Blot检测HMOX1蛋白表达。用Hmox1的激动剂COPP和抑制剂ZNPP分别同BMP9共同处理C3H10T1/2,碱性磷酸酶（ALP）染色以及定量分析和茜素红S染色检测Hmox1对BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化的影响,油红O染色检测Hmox1对BMP9诱导的C3H10T1/2成脂分化的影响。构建过表达Hmox1的腺病毒（Ad-Hmox1）,q PCR和Western Blot验证Ad-Hmox1的有效性。Ad-Hmox1与BMP9处理C3H10T1/2,ALP染色和定量分析检测成骨早期指标,q PCR检测相关转录因子Runx2、Dlx5、Id1、...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMP9对Hmox1表达的影响
18图 2. COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导下的成骨分化的影响Fig 2. The effect of COPP and ZNPP on the osteogenic differentiation induced by BMP9(A)(B) BMP9-induced ALP activity was increased after treatment of COPP while decreasedafter treatment of ZNPP. (C) BMP9-induced calcium deposition was promoted after treatment ofCOPP while decreased after treatment of ZNPP at 14d and 21d. *p<0.05, ***p<0.0012.3 COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导的 C3H10T1/2 成脂分化的影响30 M COPP 或 10 M ZNPP 处理细胞 24h，加入 BMP9 条件培养基，于第 14d、25d 进行油红 O 染色，观察脂滴形成情况。结果显示： COPP 使 BMP9 诱导的脂滴形成减少而 ZNPP 使脂滴形成增多（图 3）。
图 3. COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导的 C3H10T1/2 成脂分化的影响Fig 3. The effect of COPP and ZNPP on the adipogenic differentiation induced by BMP9COPP inhibited while ZNPP increased lipid droplets induced by BMP9 at 14d and 25d.2.4 Hmox1 过表达质粒的构建和腺病毒包装、有效性验证高保真 PCR 扩增 Hmox1 基因的编码序列，电泳结果显示 800bp 左右的目的条带，将酶切的载体和目的片段连接后转入 DH10B，挑菌做菌落 PCR，阳性条带在 500bp 左右（图 4A）；PmeⅠ线性化测序正确的质粒，电转入 BJeasy 进行同源重组，PacⅠ酶切重组质粒，释放出 30kb 的大片段和 4kb 左右的小片段（图 4B）；经 lipo 2000 转染进 HEK293 细胞中，第 3 天表达红色荧光，第 5 天荧光表达增多，提示腺病毒包装成功（图 4C）；用扩增到一定滴度的病毒感染 C3H10T1/2 细胞，在第 3 天收集蛋白做 Western Blot，结果显示 Hmox1 蛋白表达增加（图 4D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]血红素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用[J]. 陈晓鹏,胡永成,方成,张丽娟,张荣信,黄文敬. 天津医科大学学报. 2015(05)
[2]血红素加氧酶1在骨髓间充质干细胞中抗凋亡作用研究[J]. 白海,王存邦,张玲,马晓慧,葸瑞,张茜,周进茂. 中华医学杂志. 2012 (32)
本文编号：3511281
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMP9对Hmox1表达的影响
18图 2. COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导下的成骨分化的影响Fig 2. The effect of COPP and ZNPP on the osteogenic differentiation induced by BMP9(A)(B) BMP9-induced ALP activity was increased after treatment of COPP while decreasedafter treatment of ZNPP. (C) BMP9-induced calcium deposition was promoted after treatment ofCOPP while decreased after treatment of ZNPP at 14d and 21d. *p<0.05, ***p<0.0012.3 COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导的 C3H10T1/2 成脂分化的影响30 M COPP 或 10 M ZNPP 处理细胞 24h，加入 BMP9 条件培养基，于第 14d、25d 进行油红 O 染色，观察脂滴形成情况。结果显示： COPP 使 BMP9 诱导的脂滴形成减少而 ZNPP 使脂滴形成增多（图 3）。
图 3. COPP、ZNPP 对 BMP9 诱导的 C3H10T1/2 成脂分化的影响Fig 3. The effect of COPP and ZNPP on the adipogenic differentiation induced by BMP9COPP inhibited while ZNPP increased lipid droplets induced by BMP9 at 14d and 25d.2.4 Hmox1 过表达质粒的构建和腺病毒包装、有效性验证高保真 PCR 扩增 Hmox1 基因的编码序列，电泳结果显示 800bp 左右的目的条带，将酶切的载体和目的片段连接后转入 DH10B，挑菌做菌落 PCR，阳性条带在 500bp 左右（图 4A）；PmeⅠ线性化测序正确的质粒，电转入 BJeasy 进行同源重组，PacⅠ酶切重组质粒，释放出 30kb 的大片段和 4kb 左右的小片段（图 4B）；经 lipo 2000 转染进 HEK293 细胞中，第 3 天表达红色荧光，第 5 天荧光表达增多，提示腺病毒包装成功（图 4C）；用扩增到一定滴度的病毒感染 C3H10T1/2 细胞，在第 3 天收集蛋白做 Western Blot，结果显示 Hmox1 蛋白表达增加（图 4D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]血红素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用[J]. 陈晓鹏,胡永成,方成,张丽娟,张荣信,黄文敬. 天津医科大学学报. 2015(05)
[2]血红素加氧酶1在骨髓间充质干细胞中抗凋亡作用研究[J]. 白海,王存邦,张玲,马晓慧,葸瑞,张茜,周进茂. 中华医学杂志. 2012 (32)
本文编号：3511281
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