抗菌肽Plectasin高效原核表达菌株的构建及表达条件优化的正交试验

发布时间：2017-05-10 05:13

  本文关键词：抗菌肽Plectasin高效原核表达菌株的构建及表达条件优化的正交试验，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[背景]随着广谱抗生素在临床上的广泛应用,革兰氏阳性球菌细菌耐药性问题日益严峻,这增加了疾病治愈的难度并给患者和社会带来了严重的经济负担。细菌耐药产生的原因是多方面的,其中抗菌药物的广泛使用和滥用最为主要。抗生素的长期大量使用除了诱发细菌的广泛耐药之外,还会导致诸多不良反应和毒副作用,如肝肾功能损害、血液和神经系统毒性、胃肠道反应等,这些不良反应也同样影响了敏感抗生素在治疗耐药革兰阳性球菌感染中的选择,因此开发新一代具有生物活性的抗菌物质显得尤为迫切和必要。抗菌肽是一种具有高效抗菌、抗病毒和免疫调节功能的多肽,是动物先天免疫的重要组成部分。研究表明：抗菌肽广泛存在于各种生物体内,对细菌、真菌、病毒、原虫甚至癌细胞都有不同程度的抑制和杀灭作用。与传统抗生素相比,抗菌肽因作用机制独特而不易产生耐药性,部分抗菌肽还具备免疫调节活性。目前已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。美国Magainin公司开发的抗菌肽Pexiganan已成功应用于临床治疗糖尿病足感染。2002年从腐生真菌中发现新型抗菌肽——菌丝霉素Plectasin,它对肺炎球菌、金黄色葡萄球菌及肠球菌,包括耐药型的肺炎球菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)都有良好的杀灭作用,且毒副作用非常小,这一发现显示了Plectasin的强大的应用潜力。生物体内天然抗菌肽含量很低,直接分离纯化步骤繁杂耗时,而通过化学合成的方法大量生产抗菌肽则价格昂贵,因此,寻找一种更具成本效益的生产方法成为抗菌肽产业化的又一关键点。随着生物技术的逐步成熟和市场的需要呈上升趋势,重组抗菌肽成为多肽类药物产业化的主要方向之一。目前,大多数抗菌肽由像大肠杆菌表达系统这样的原核表达系统表达,但使用大肠杆菌表达系统生产Plectasin目前报道较少。原核表达系统直接表达抗菌肽存在以下问题：1、大多数抗菌肽对大肠杆菌有抗菌活性；2、大多数表达蛋白以包涵体的形式存在；3、大肠杆菌缺乏翻译后修饰和加工功能；4、表达的蛋白容易被蛋白酶降解；针对上述问题,目前通常采用融合表达策略来解决,利用不同功能的分子伴侣与抗菌肽在大肠杆菌中进行融合表达可以降低抗菌肽对宿主的毒害作用,提高表达蛋白可溶性和稳定性,并且可以设计特定的裂解位点释放抗菌肽。随着生物技术的飞速发展,利用微生物发酵生产抗菌肽不失为一种经济高效的方法。构建高效重组大肠杆菌系统表达抗菌肽Plectasin,对表达的Plectasin进行体外活性检测,并对其表达条件进行优化,对推动针对耐药革兰阳性球菌感染的新型抗菌药物——抗菌肽的研发具有积极意义。[目的]本实验拟选取硫氧还蛋白(TrxA)、小泛素相关修饰物(SUMO)、内含肽(Intein2)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)四种不同的分子伴侣分别构建重组大肠杆菌菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-P S、Origami-pGEX-5x-2-PS对抗菌肽Plecatsin融合表达,综合表达融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin最终理论产量,筛选出合适的分子伴侣和高效的重组大肠杆菌菌株。利用实验中获得Plectasin进行体外抗菌活性实验,观察Plectasin对MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)抗菌活性,测定Plectasin对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。观察Plectasin在不同pH和温度条件下的活性和稳定性。选取诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间三个因素设计正交试验,对Plectasin原核表达条件进行优化,探索Plectasin原核表达的合适条件。最终为Plectasin进一步研究、生产及应用奠定基础。[方法]1抗菌肽Plectasin高效原核表达菌株的构建1.1 Plectasin基因的修饰根据Mandal的研究获得Plectasin氨基酸序列,基于大肠杆菌同义密码子偏好性,设计优化的Plectasin基因序列。Plectasin基因两端分别添加相应的限制性内切酶识别序列和切割酶识别序列。1.2重组质粒的构建和识别Plectasin修饰基因经过相应的限制性内切酶处理后,分别连接到经过相同内切酶处理过的质粒构成重组质粒pGEX-5x-2-PS。Plectasin基因序列与TrxA、SUMO、Intein2、GST四种分子伴侣的基因序列分别进行重组,构建融合表达基因,分别被命名为1rxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS、GST-PS。四种重组质粒分别被转化到大肠杆菌DH5α菌株用于质粒扩增。通过聚合酶链反应(PCR)、双酶切法和DNA测序确定重组质粒成功构建。1.3融合蛋白的测定重组质粒被转化到大肠杆菌Origami (DE3)菌株用于融合蛋白表达。经诱导后,通过离心获得菌株,用声波降解法对菌株进行破解并离心获得上层清液及沉淀。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别检测经诱导的全菌蛋白、未经诱导的全菌蛋白、破菌离心上清液和破菌离心沉淀中融合蛋白表达情况,确定融合蛋白的可溶性。使用Bradford蛋白检测法和QuantityOne软件测定超声上清液中蛋白总含量和融合蛋白占总蛋白比例,最后计算出上清液融合蛋白含量和Plectasin理论产量。1.4融合蛋白的提取通过离心获得菌株,使用声波降解法对菌株进行破解,再通过离心获得上清液并在过滤器中过滤。1.5融合蛋白的纯化和切割使用镍离子螯合层析法和几丁质亲和层析法对破菌上清液中融合蛋白进行纯化。使用相应的切割酶对纯化的融合蛋白进行切割,使用SDS-PAGE对切割结果进行检测。1.6切割产物Plectasin的确定使用SDS-PAGE对融合蛋白切割产物Plectasin进行确定。2纯化抗菌肽Plectasin体外活性实验2.1最终产物的纯度分析融合蛋白SUMO-PS切割后获得最终产物Plectasin经过三甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)检测和分子成像系统(Bio-Red Laboratories)分析以验证纯度。2.2P lectasin抗菌活性检测利用Kirby-Bauer纸片扩散法抗生素敏感性试验(K-B法)检测Plectasin对MRSA、PRSP、VRE的抗菌活性。2.3 MIC和MBC测定通过制作悬菌液、制备抗菌肽在96孔平板上采用浓度稀释法测定Plectasin的MIC和MBC。比较Plectasin和氨苄青霉素钠(Amp)对不同细菌的MIC和MBC。2.4不同pH和温度对Plectasin活性和稳定的影响设置不同pH梯度(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同温度梯度(0、25、50、75、100℃),使用K-B方法观察pH和温度对Plectasi n抗菌活性和稳定性的影响。3.抗菌肽Plectasin原核表达条件优化的正交实验3.1 Plectasin融合表达基因的合成根据Mandal的研究获得Plectasin氨基酸序列,基于大肠杆菌同义密码子偏好性,设计优化的Plectasin基因序列。Plectasin基因序列同分子伴侣SUMO的基因序列进行重组,融合基因命名为SUMO-PS。3.2重组质粒的构建和识别融合基因SUMO-PS经过相应的限制性内切酶处理后,连接到经过相同处理过的质粒。重组的质粒被转化到大肠杆菌DH5a菌株用于质粒扩增。通过PCR、双酶切法和DNA测序确定重组质粒成功构建。3.3正交试验设计选取诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间三个因素,并且在各个因素的3个水平设计正交试验对表达条件进行优化。3.4融合蛋白优化表达及定量按照已设计的正交试验对融合蛋白诱导表达,并使用15%SDS-PAGE对表达融合蛋白进行检测。使用标准SDS-PAGE法估算出到各组可溶融合蛋白的量。3.5数据分析使用SPSS13.0统计软件对本实验数据进行分析,可得出三个主要因素诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度顺序和优化表达条件。[结果]1抗菌肽Plectasin高效原核表达菌株的构建1.1重组质粒的构建琼脂糖凝胶电泳显示于156bp、140bp、159bp、141bp处出现特异条带,证明重组质粒pET-32a(+)-PS、pE-SUMO-PS、pTWIN1-C-PS、pGEX-5x-2-PS构建成功,DNA测序也证明了四种重组质粒构建成功。1.2融合蛋白的测定电泳结果显示预期分子质量(22kDa、24kDa、30kDa、30kDa)的四种蛋白在诱导后全菌蛋白中出现,提示四种融合蛋白成功表达。重组菌株Origami-pET-32a(+)-PS、Origami-pE-SUMO-PS、Origami-pTWIN1-C-PS、Origami-pGEX-5x-2-PS破菌上清液中总蛋白含量分别为0.7200 g/L、0.5800 g/L、1.0880 g/L、0.7981 g/L；四种融合蛋白占上清液中总蛋白比例分别为24.06%、23.44%、16.04%、21.04%；上清液中四种融合蛋白含量分别为0.1732 g/L、0.1359g/L、0.1745g/L、 0.1708g/L; Plectasin理论产量分别为0.0356 g/L、0.0358 g/L、0.0238g/L、0.02 43g/L。1.3融合蛋白的纯化和切割融合蛋白TrxA-PS切割产物电泳结果出现特异靶蛋白带,但大多数融合蛋白未被完全切割； SUMO-PS切割产物电泳结果出现特异性靶蛋白条带,部分融合蛋白未被完全切割。融合蛋白intein2-PS切割产物电泳结果出现特异性靶蛋白带,但大多数融合蛋白未被完全切割。1.4最终产物的确定电泳结果显示融合蛋白TrxA-PS、SUMO-PS、Intein2-PS经切割后最终产物显示特异条带。2纯化抗菌肽Plectasin体外活性实验2.1融合蛋白最终产物的纯度分析根据Tricine-SDS-PAGE电泳结果,分子成像系统显示获得Plectasin的纯度为98.3%。2.2 Plectasin抗菌活性检测Plectasin对MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性。Amp对PRSP、VRE有抗菌活性,但对MRSA无抗菌活性。2.3 MIC和MBC测定Plecatsin对MRSA 1547111、MRSA 15471118、PRSP 31355、VRE的MIC分别64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L).32μg/ml(7.3μmol/L)、64μg/ml(1 4μmol/L); Amp对MRSA 15471114. MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MIC分别为64μg/ml(186μmol/L).128μg/ml(373μmol/L).16μg/ml(46μmol/L).3 2μg/ml(96μmol/L); Plecatsin对MRSA 15471114, MRSA 15471118、PRSP 313 55, VRE的MBC分别为64μg/ml(14μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L)、32μg/ml(7.3 μmol/L)、64μg/ml(14μmol/L); Amp对MRSA 15471114、MRSA 15471118、PRSP 31355. VRE的MBC分别为64μg/ml(186μmol/L)、128μg/ml(373μmol/L)、1 ).32μg/ml(96μmol/L)。Plectasin和Amp对受检临床耐药菌株的MIC和MBC有差异,差异有统计学意义(P0.05)。2.4不同pH和温度对Plectasin活性和稳定性的影响在不同pH梯度下(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0)和不同温度梯度下(0、25、50、75、100℃),Plectasin显示较强的活性和稳定性。3抗菌肽P lectasin原核表达条件优化的正交实验3.1重组质粒的构建PCR扩增结果显示融合基因SUMO-PS被成功连接到载体上,DNA测序也证明了重组质粒构建成功3.2融合蛋白表达结果各实验组破解后全菌蛋白SDS-PAGE结果显示在24kDa处均有特异蛋白条带,表明融合蛋白成功表达。各实验组破菌上清SDS-PAGE结果显示各实验组在24kDa处均有特异蛋白条带,并且表达量有明显差异。3.3融合蛋白表达定量标准SDS-PAGE法结果显示实验组4融合蛋白表达量是最高的,为142mg/L,实验组6表达量最低,为4.71mg/L,实验组5、8、9表达量也较高,分别为42.67mg/L.44mg/L.46.67mg/L。3.4数据分析使用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析可得出影响因素强度由高到低分别为诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度,而结果显示优化诱导条件为30℃、6h和0.05mmol/L IPTG。[结论]1本研究成功构建Plectasin高效表达的重组大肠杆菌菌株Origami-pE-SUMO-PS和Origami-pET-32a(+)-PS。综合融合蛋白的可溶性、切割效率、Plectasin理论产量等因素,SUMO和TrxA是Plectasin大肠杆菌融合表达理想分子伴侣；2重组大肠杆菌菌株Origami-pE-SUMO-PS表达的Plectasin对MRSA、PRSP、VRE均有抗菌活性；在不同温度和pH条件下,Plectasin仍表现出良好的活性和稳定性；3影响抗菌肽Plectasin在重组大肠杆菌表达系统融合表达的因素强度由强到弱分别为诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度,优化诱导条件为30℃、6h和0.O5mmol/L IPTG。
【关键词】：Plectasin 分子伴侣 大肠杆菌 融合蛋白 抗菌活性 正交试验
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411;Q78
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 第一章 抗菌肽Plectasin高效原核表达菌株的构建23-42
• 第一节 引言23-24
• 第二节 材料与方法24-32
• 第三节 结果32-39
• 第四节 讨论39-41
• 第五节 结论41-42
• 第二章 纯化抗菌肽Plectasin体外活性实验42-52
• 第一节 引言42
• 第二节 材料与方法42-45
• 第三节 结果45-48
• 第四节 讨论48-50
• 第五节 结论50-52
• 第三章 抗菌肽Plectasin原核表达条件优化的正交试验52-63
• 第一节 引言52
• 第二节 材料与方法52-56
• 第三节 结果56-60
• 第四节 讨论60-62
• 第五节 结论62-63
• 全文总结63-64
• 参考文献64-70
• 英文缩写略词表70-71
• 成果71-73
• 致谢73-75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 石慧;梁运祥;;标准SDS-PAGE图法测定大豆11S抗原蛋白含量的研究[J];饲料工业;2011年07期

2 杨文理;陈守春;陈毅荣;覃扬;;TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究[J];四川大学学报(医学版);2006年05期

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本文编号：354094