诃子提取物HZ4对脑梗死模型的作用及药理学机制研究

发布时间：2017-05-11 02:03

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【摘要】：目的：脑梗死及后遗症属于严重威胁人类健康的重大疾病,发病率较高。脑梗死后遗症发病机制复杂,临床上缺乏理想的治疗方法及药物。近年来,干细胞疗法为脑梗死后遗症患者带来了希望。神经干细胞(neural stem cell, NSCs)起源于多潜能干细胞,具有自我更新以及多分化潜能,最新研究表明,激活内源性NSCs增殖分化可以促进脑功能重塑,对脑梗后神经系统的功能恢复具有巨大的潜能,成为当前治疗脑梗死后遗症的重要方向。诃子作为一种传统民族药物,在中医及少数民族传统医学中有着悠久的应用历史,被称为“藏药之王”。现代研究显示,诃子具有神经保护和细胞保护作用,具有重要的临床应用价值。诃子含有多种神经保护及促进神经功能康复的活性成分,为治疗脑梗死后遗症提供了可能,值得深入研究。本实验室在2009年利用正丁醇、乙酸乙酯和乙醇提取等步骤获得了一种诃子乙醇提取物(HZ4),并初步发现其具有较好的神经保护和促NSCs增殖活性。为了研究HZ4治疗脑梗死后遗症的作用效果以及探讨可能的分子机制,本实验分别从整体动物水平和细胞水平进行药理学研究,为HZ4治疗脑梗死后遗症的应用潜力提供实验依据。方法：1.雄性健康的SD大鼠随机分为假手术组、模型组、三七总皂苷阳性对照组、HZ4高、中、低剂量组。采用光化学法建立大鼠局灶性脑梗死模型。利用平衡木实验、足失误实验和双边触觉胶去除实验等行为学测定方法来研究HZ4对脑梗死后大鼠神经功能缺失的影响；同时,通过检测脑梗死体积、脑组织病理变化、血脑屏障通透性以及血清LDH的含量研究了HZ4对脑组织的保护作用；测定了大鼠血清中T-AOC、SOD及MDA的变化,研究了HZ4对脑梗死大鼠血清的抗氧化能力；采用免疫组织化学法检测了脑梗死后NSCs的标志蛋白Nestin的表达变化情况,并利用RT-PCR技术检测了Wnt和Notch信号通路中P-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1在内的四个关键节点基因的表达变化,研究HZ4对脑梗死大鼠模型可能的作用分子机制。2,半悬浮培养法体外培养大鼠大脑皮层NSCs,并利用免疫荧光法鉴定NSCs的生物特性；建立NSCs氧糖剥夺复供模型(OGD/R),并将实验分为正常对照组、模型组、三七总皂苷阳性对照组、HZ4高、中、低剂量组。采用CCK-8法测定NSCs的细胞活力,研究HZ4对NSCs的保护作用；同时利用RT-PCR技术测定β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四个关键节点基因的表达变化,研究HZ4对NSCs增殖影响的可能分子机制。结果：1.HZ4对脑梗死大鼠脑组织具有明显保护作用：与假手术组相比,模型组大鼠出现严重的神经功能缺失现象,病灶周边处病理表现为结构疏松且细胞排列紊乱、核固缩等,大脑出现明显梗死现象(P0.01),并且血脑屏障的通透性破坏,血清抗氧化能力明显下降(P0.01)。与模型组相比,给药组大鼠神经功能损伤程度及病理变化得到明显的改善,大鼠的梗死体积和血脑屏障通透性得到显著地减少(P0.05),同时发现血清抗氧化能力也有所提高。2.HZ4促进了脑梗死大鼠内源性NSCs和体外OGD/R损伤的NSCs增殖活性：与假手术组相比,脑梗死损伤可以明显上调NSCs的标志性蛋白Nestin的含量(P0.01)；而各给药组大鼠内源性NSCs增殖能力明显提高,脑组织内Nestin蛋白的含量较模型组显著增多(P0.05)。体外实验发现,与正常对照组相比,经过OGD/R损伤的NSCs的细胞活力明显下降(P0.01)；而各给药组NSCs的细胞活力明显优于模型组(P0.05)。3.HZ4对脑梗死大鼠脑组织和体外OGD/R损伤的NSCs Wnt和Notch信号通路相关基因表达的影响：大鼠脑梗死给药7 d后,与模型组相比,给药组Wnt和Notch信号通路中β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四个关键节点基因的表达均明显地上调(P0.05)。同时,在体外实验中, Wnt和Notch信号通路中β-catenin、Cyclin D1、Notchl和Hes1四个关键节点基因的表达上调变化得到证实。结论：本实验在整体水平和细胞水平发现诃子提取物HZ4具有明显的神经保护作用,可以改善模型动物的神经行为学功能,并且这种作用与其调控Wnt和Notch两条信号通路,促进内源性NSCs增殖有关。本研究首次证实HZ4激活Wnnt和Notch两条信号通路,形成一个生物网络进而调控NSCs的增殖,有一定的创新性。
【关键词】：HZ4 局灶性脑梗死 神经干细胞 增殖 Wnt信号通路 Notch信号通路
【学位授予单位】：中央民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R29;R-332
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-19
• 英文缩略词表19-20
• 第一章 前言20-28
• 第一节 脑梗死的病理及治疗研究现状20-23
• 一、脑梗死概述20
• 二、脑梗死后遗症的治疗策略20-23
• 1. 治疗脑梗死的常用方法概况21
• 2. 应用神经干细胞治疗脑梗死21-23
• 第二节 神经干细胞增殖的主要分子信号通路研究进展23-27
• 一、Wnt信号通路及其对NSCs增殖的调控作用23-24
• 二、Notch信号通路及其对NSCs增殖的调控作用24-25
• 三、基于网络药理学理论分析NSCs增殖的网络机制25-27
• 第三节 诃子的活性研究27-28
• 第二章 整体水平研究HZ4对脑梗死的药效作用及其分子机制28-62
• 第一节 实验材料28-31
• 一、实验动物28
• 二、主要实验仪器及器材28
• 三、主要实验试剂28-30
• 四、主要溶液的配制30-31
• 第二节 实验方法31-43
• 一、成年大鼠局灶性脑梗死模型的建立31-32
• 二、分组与给药32-33
• 三、行为学研究方法33-35
• 1. 平衡木实验方法33-34
• 2. 足失误实验方法34-35
• 3. 双边触觉胶去除实验方法35
• 四、脑组织病理学研究方法35
• 五、TTC染色法测定大鼠脑梗死体积35-36
• 六、大鼠血脑屏障通透性检测方法36
• 七、明胶酶谱法测定MMP-9蛋白的含量36-39
• 八、大鼠血清生化指标的测定方法39-40
• 九、免疫组化技术检测Nestin蛋白的表达40
• 十、RT-PCR技术检测Wnt和Notch通路中关键基因的表达40-43
• 十一、数据处理43
• 第三节 实验结果43-58
• 一、实验大鼠的体重变化及一般生存情况43
• 二、行为学研究结果43-45
• 1. 平衡木实验结果43-44
• 2. 足失误实验结果44
• 3. 双边触觉胶去除实验结果44-45
• 三、HZ4对脑组织缺血区的保护作用45-50
• 1. 病理学研究结果45-46
• 2. HZ4对模型大鼠脑梗死体积的影响46-48
• 3. HZ4对血脑屏障的影响48-50
• 四、HZ4对血清LDH、T-AOC、SOD和MDA的影响50-52
• 五、脑组织Nestin免疫组织化学染色结果52-53
• 六、Wnt和Notch通路中关键基因的表达变化53-58
• 1. 提取的总RNA纯度检测结果53
• 2. 提取的总RNA完整性检测结果53-54
• 3. HZ4对脑梗死后β-catenin基因表达的影响54-55
• 4. HZ4对脑梗死后Cyclin D1基因表达的影响55-56
• 5. HZ4对脑梗死后Notch1基因表达的影响56-57
• 6. HZ4对脑梗死后Hes1基因表达的影响57-58
• 第四节 讨论58-61
• 第五节 小结61-62
• 第三章 细胞水平初步研究HZ4促NSCs增殖作用62-77
• 第一节 实验材料62-64
• 一、实验动物62
• 二、主要实验仪器及器材62
• 三、实验试剂62-63
• 四、主要溶液配制63-64
• 第二节 实验步骤64-68
• 一、神经干细胞的分离与培养64
• 二、神经干细胞的鉴定64-65
• 三、神经干细胞氧糖剥夺复供(OGD/R)模型的制备65
• 四、分组与给药65-66
• 五、神经干细胞活力测定66
• 六、利用RT-PCR技术检测关键节点基因的表达变化66-67
• 七、数据处理67-68
• 第三节 实验结果68-74
• 一、神经干细胞的形态学观察及鉴定结果68
• 二、HZ4对OGD/R损伤后神经干细胞形态的影响68-69
• 三、HZ4对OGD/R损伤后神经干细胞的细胞活力的影响69-70
• 四、HZ4对Wnt和Notch通路中关键基因的表达影响70-74
• 1. 提取的总RNA纯度和完整性检测结果70-71
• 2. HZ4对OGD/R损伤NSCs后β-catenin基因的影响71
• 3. HZ4对OGD/R损伤NSCs后Cyclin D1基因的影响71-72
• 4. HZ4对OGD/R损伤NSCs后Notch1基因的影响72-73
• 5. HZ4对OGD/R损伤NSCs后Hes1基因的影响73-74
• 第四节 讨论74-76
• 第五节 小结76-77
• 第四章 全文总结77-78
• 参考文献78-85
• 致谢85-86
• 攻读学位期间发表的学术成果目录86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈小玉;庄述娟;刘庆山;;诃子神经保护作用的药效物质基础[J];时珍国医国药;2012年10期

  本文关键词：诃子提取物HZ4对脑梗死模型的作用及药理学机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：355968