人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究
发布时间：2022-01-09 20:10
本研究在标准化cGMP条件下从人体脂肪组织分离获得脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells,ADSCs）,并在无血清培养条件下大规模扩增培养,并对获得的细胞质量进行标准化鉴定及功能验证。建立无分化、大规模扩增培养,预期形成一套国际标准培养体系。在密闭运输脂肪抽吸物至实验室,实验中采用酶消化法及差速离心方法分离得到基质血管分离段（Stromal Vascular Fraction,SVF）,差速贴壁方法纯化ADSCs,并在所配制的无血清培养基中扩增培养。采用流式检测鉴定脂肪干细胞（ADSCs）表面标记物。取第三代ADSCs细胞培养于6孔板之内,用含有脂肪分化、成骨分化和软骨分化诱导剂的培养基中分别进行诱导分化2-3周时间,并分别用2%油红染色剂、茜素红染色剂及用阿利新蓝冰醋酸染色剂分别染色鉴定其细胞分化状况。在实验中我们分离纯化所得到的细胞在无血清培养条件下稳定培养至10代以上时并无出现分化现象,细胞形态呈细、短、小梭形、细胞饱满、大小均一且漩涡状生长。细胞培养密度为5000/cm2时,倍增时间为20-25 h,细胞直径范围在16-20μm时...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
脂肪来源干细胞（ADSCs）的获得、分离和鉴定过程示意图
5 分钟，离心，弃上清；入 100μL buffer I 工作液，逐管加入对应荧光抗体，涡漩振 min；并上流式细胞仪检测 ADSCs 细胞表面标记物；2.3 实验结果2.3.1 脂肪细胞的分离的人来源脂肪组织置于超净工作台，在无菌环境下分装于 50 m及用 0.5%Ⅰ型胶原酶及 0.25% 胰蛋白酶共同消化下，分离得到条件下，震荡 30 min，1 h，并采用密度梯度离心方法得到 SVF，扩增培养做准备。AB
2.3.2 脂肪干细胞原代细胞培养及体外扩增密度梯度离心及酶消化法分离得到 SVF，差速贴壁方法分离提纯 ADSCs 细胞。如图代数的增加，ADSCs 纯度变高，在无血清培养条件下成功建立了原代培养体系，具、高纯度、稳定可重复性及安全性的原代脂肪干细胞培养体系。分离培养获得的群中无纤维母细胞、内皮细胞及平滑肌细胞，无絮状物。镜下动态观察：脂肪干细胞培养后的第一天，少量细胞贴壁，细胞呈圆形；第三天梭形，且细胞体积比 P1 代细胞大，排列方向不均匀；随着代数的增加，ADSC 体积排列方向规则，呈现出螺旋状生长。随着代数的增加，细胞未呈现出形态差异；在期间，每隔三天传一次代，按照 5000/cm2细胞密度接种，当细胞融合度达到 80%-传代。
【参考文献】：
期刊论文
[1]诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展[J]. 纪晓琳,王慷慨,王念. 中南大学学报(医学版). 2019(02)
[2]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[3]富血小板血浆对体外培养人脂肪来源干细胞增殖及成脂分化的作用[J]. 张云松,何井华,肖冠英,黎庆梅. 南方医科大学学报. 2011(03)
本文编号：3579365
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
脂肪来源干细胞（ADSCs）的获得、分离和鉴定过程示意图
5 分钟，离心，弃上清；入 100μL buffer I 工作液，逐管加入对应荧光抗体，涡漩振 min；并上流式细胞仪检测 ADSCs 细胞表面标记物；2.3 实验结果2.3.1 脂肪细胞的分离的人来源脂肪组织置于超净工作台，在无菌环境下分装于 50 m及用 0.5%Ⅰ型胶原酶及 0.25% 胰蛋白酶共同消化下，分离得到条件下，震荡 30 min，1 h，并采用密度梯度离心方法得到 SVF，扩增培养做准备。AB
2.3.2 脂肪干细胞原代细胞培养及体外扩增密度梯度离心及酶消化法分离得到 SVF，差速贴壁方法分离提纯 ADSCs 细胞。如图代数的增加，ADSCs 纯度变高，在无血清培养条件下成功建立了原代培养体系，具、高纯度、稳定可重复性及安全性的原代脂肪干细胞培养体系。分离培养获得的群中无纤维母细胞、内皮细胞及平滑肌细胞，无絮状物。镜下动态观察：脂肪干细胞培养后的第一天，少量细胞贴壁，细胞呈圆形；第三天梭形，且细胞体积比 P1 代细胞大，排列方向不均匀；随着代数的增加，ADSC 体积排列方向规则，呈现出螺旋状生长。随着代数的增加，细胞未呈现出形态差异；在期间，每隔三天传一次代，按照 5000/cm2细胞密度接种，当细胞融合度达到 80%-传代。
【参考文献】：
期刊论文
[1]诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展[J]. 纪晓琳,王慷慨,王念. 中南大学学报(医学版). 2019(02)
[2]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[3]富血小板血浆对体外培养人脂肪来源干细胞增殖及成脂分化的作用[J]. 张云松,何井华,肖冠英,黎庆梅. 南方医科大学学报. 2011(03)
本文编号：3579365
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