利用慢病毒介导hTERT基因建立永生化髓核细胞系

发布时间：2022-02-14 13:02

　　目的以慢病毒介导人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因转染体外培养的人髓核细胞,建立永生化髓核细胞系,为后期转基因与动物实验提供种子细胞。方法利用机械与酶消化的方法获得正常的人椎间盘髓核细胞,将构建好的重组慢病毒-hTERT（pLVX-hTERT）转染第2代体外单层培养的髓核细胞。用重组慢病毒-增强型绿色荧光蛋白作为标记物,在荧光电镜下观察细胞转染效率,按感染复数（MOI）40、60、80、100设组,选择出病毒转染的最佳MOI;设立pLVX-hTERT转染组、空病毒转染对照组及空白细胞对照组。在倒置显微镜下观察髓核细胞的形态,用反转录聚合酶链反应、细胞免疫荧光技术检测转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达情况,用反转录聚合酶链反应检测髓核细胞Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达情况。结果慢病毒转染细胞后第6天,MOI为100时转染效率最高,可达82.9%。pLVX-hTERT转染组在转染后第7、15、30、60、90天均可检测到hTERT基因的表达,而两对照组则未见表达。pLVX-hTERT转染组保持了髓核细胞的形态,两对照组的细胞则出现返祖现象。pLVX-hTERT转染组细胞的蛋白多糖及Ⅱ型胶原基... 

【文章来源】：青岛大学学报(医学版). 2020,56(05)

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

同一视野下荧光电镜及光镜的髓核细胞观察

RT-PCR检测的结果显示,pLVX-hTERT转染组细胞的蛋白多糖及Ⅱ型胶原基因表达水平较两对照组均明显增高(F=173.5、111.1,P<0.05),而两对照组之间差异则无显著意义(P>0.05)。转染第15天后,随着hTERT基因的稳定高表达,pLVX-hTERT转染组髓核细胞中蛋白多糖及Ⅱ型胶原基因表达水平也达到较稳定的高表达状态,各转染组之间差异无显著性(P>0.05)。见表2。表2 各组Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达水平比较 ( n= 5, x ˉ ±s) 组别 Ⅱ型胶原 蛋白多糖 A组 0.327±0.061 0.153±0.003 B组 0.311±0.440 0.151±0.004 C组 第7天 0.468±0.008 0.218±0.011 第15天 0.533±0.011 0.278±0.015 第30天 0.528±0.010 0.276±0.009 第60天 0.526±0.013 0.271±0.015

【参考文献】：
期刊论文
[1]重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因转染对人髓核细胞功能的影响[J]. 吴剑宏,阮狄克,王德利,张超,何勍,王超锋,张燕,辛洪奎,顾韬,徐成,刘玥.  中国脊柱脊髓杂志. 2012(09)
[2]人正常椎间盘髓核细胞体外不同培养代次的生物学性状分析:适应于组织工程椎间盘种子细胞的选择[J]. 叶冬平,梁伟国,戴丽冰,沈雁.  中国组织工程研究与临床康复. 2010(24)
[3]端粒酶转染大鼠胰岛素分泌细胞建立的永生化细胞系[J]. 任甫,侯续伟,徐国昌,尹波.  中国组织工程研究与临床康复. 2009(33)
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[5]椎间盘细胞培养过程中的反分化研究[J]. 陈岩,胡有谷,刘勇.  中国脊柱脊髓杂志. 2000(03)



本文编号：3624607