利用CRISPR/Cas9技术构建亨廷顿疾病（HD）原位敲入小鼠模型

发布时间：2022-02-24 11:55

　　背景:亨廷顿疾病（Huntington’s Disease,HD）是一种具有神经退行性的常染色体显性遗传类疾病,其最明显的临床症状是患者出现不自主舞蹈样动作,故该疾病也被称为亨廷顿舞蹈症。研究表明,HD具有年龄依赖性特征,即随着年龄增加HD患者的病情会逐渐加重直至死亡。目前认为人类HD致病原因是其4号常染色体上的亨廷顿基因（Htt）外显子1发生了CAG序列的异常突变加长,导致正常亨廷顿蛋白的错误折叠形成亨廷顿突变蛋白（mutant Huntingtin,mHtt）,细胞无法将mHtt完全清除,当mHtt累积聚集到一定程度后,会造成脑部纹状体神经元细胞变性和脑组织萎缩坏死。一般而言,CAG异常突变的长度越长,HD的发病年龄越早,疾病表型也会越严重。现在常用的HD小鼠模型主要有以下三种:1)采取基因敲除方式靶向破坏致病基因的“敲除小鼠模型”;2)通过外源基因或启动子的引入,条件过表达mHtt突变蛋白的N末端或者过表达全长突变蛋白的“转基因小鼠模型”;3)仅在小鼠自身内源性启动子调控下改变内源基因的“敲入小鼠模型”。目前,随着CRISPR/Cas9等新兴基因编辑技术的快速发展,研究人员在构建... 

【文章来源】：西南大学重庆市211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：100 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要英文缩略词
第1章 文献综述
    1.1 三核苷酸重复疾病概述
        1.1.1 常见三核苷酸重复疾病介绍
        1.1.2 多聚谷氨酰胺疾病介绍
    1.2 亨廷顿疾病概述
        1.2.1 亨廷顿疾病介绍
        1.2.2 亨廷顿疾病的临床研究
    1.3 亨廷顿疾病模型研究概述
        1.3.1 HD小鼠模型
        1.3.2 HD细胞模型
        1.3.3 HD其它模型
    1.4 基因编辑技术概述
        1.4.1 基因编辑技术介绍
        1.4.2 CRISPR/Cas9 介绍
        1.4.3 CRISPR/Cas9 在亨廷顿疾病中的实践应用
第2章 引言
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物与菌种
        3.1.2 实验试剂及配制方法
        3.1.3 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 Cas9/gRNA靶点设计及其体外酶切靶点活性检测
        3.2.2 原位敲入小鼠模型F0 代的构建
        3.2.3 原位敲入小鼠模型子代(F1、F2、F3 代)的传代与鉴定
        3.2.4 原位敲入小鼠模型RNA转录情况检测
        3.2.5 原位敲入小鼠模型蛋白质表达情况检测
第4章 实验结果与分析
    4.1 Cas9/gRNA靶点序列设计及其靶点活性结果
        4.1.1 Cas9/gRNA第一次靶点序列设计及其靶点活性结果
        4.1.2 Cas9/gRNA第二次靶点序列设计及其靶点活性结果
    4.2 F0 代小鼠基因型鉴定结果
    4.3 子代(F1、F2、F3 代)小鼠基因型鉴定结果
        4.3.1 F1 代小鼠基因型鉴定
        4.3.2 F2 代小鼠基因型鉴定
        4.3.3 F3 代小鼠基因型鉴定
        4.3.4 子代小鼠基因型单克隆菌落PCR鉴定结果
    4.4 原位敲入模型小鼠RNA转录结果
        4.4.1 小鼠各组织RNA鉴定结果
        4.4.2 小鼠各组织RNA单克隆菌落PCR鉴定结果
    4.5 原位敲入模型小鼠组织蛋白表达结果
        4.5.1 正常小鼠蛋白预实验结果
        4.5.2 模型小鼠蛋白实验结果
    4.6 原位敲入模型小鼠其它分析结果
第5章 讨论
    5.1 gRNA靶点序列对与150Q Donor质粒的构建分析
    5.2 150Q敲入小鼠模型分析
    5.3 关于150Q敲入小鼠基因型及其RNA转录相关情况说明
第6章 总结与展望
    6.1 HD原位敲入小鼠模型优势
    6.2 HD原位敲入小鼠模型不足之处
    6.3 本课题的后续实验探讨内容
参考文献
致谢
在校期间科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因编辑技术在肿瘤治疗中的应用[J]. 陈力权,李谦.  药物生物技术. 2018(06)
[2]亨廷顿舞蹈症研究现状[J]. 安平,鲁伯埙.  中国细胞生物学学报. 2018(10)
[3]动物模型在神经退行性疾病中的应用[J]. 袁亦娇,陈实.  中国细胞生物学学报. 2018(09)
[4]CRISPR/Cas系统在神经系统研究中应用的研究进展[J]. 何征晖,汪泱.  国际神经病学神经外科学杂志. 2018(04)
[5]Genome engineering using the CRISPR/Cas system[J]. Takuro Horii,Izuho Hatada.  World Journal of Medical Genetics. 2014(03)
[6]亨廷顿病经典动物模型研究进展[J]. 蒋伟,华栋,雷霆,李龄.  中华神经外科疾病研究杂志. 2010(05)
[7]Animal models of Huntington’s disease: implications in uncovering pathogenic mechanisms and developing therapies[J]. Lin-hui WANG~2 Zheng-hong QIN~(3,4) Departments of ~2Physiology and ~3Pharmacology,Soochow University School of Medicine,Suzhou 215123,China.  Acta Pharmacologica Sinica. 2006(10)



本文编号：3642671