GRP78单抗多抗的制备鉴定及其免疫学检测方法的建立

发布时间：2022-04-23 09:42

　　目的:制备与鉴定抗GRP78兔多克隆抗体与腹水型单克隆抗体,进一步建立可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:利用课题组前期已经成功构建的pW28-GRP78重组质粒,IPTG诱导表达后经过Ni²⁺-NTA亲和层析柱分离纯化获得高纯度GRP78重组蛋白;获得的GRP78蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,辛酸-硫酸铵沉淀后DEAE离子交换层析法纯化;制备GRP78腹水型单克隆抗体并鉴定其亚型,Protein G亲合柱纯化;采用Western blot、免疫荧光、免疫组化等方法对获得的GRP78兔多抗与鼠单抗进行鉴定;建立一个可检测GRP78蛋白的双抗夹心ELISA免疫学方法。结果:高效获得高纯度GRP78重组蛋白,成功制备兔多抗,同时获取8株腹水型单克隆抗体,选择效价最高的McAb-1用于后续双抗夹心ELISA实验,McAb-1为G2a型;进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性;单抗作为捕获抗体,多抗作为检测抗体,HRP标记的羊抗兔酶标二抗,成功建立可检测人GRP78的双抗夹心ELISA方法,检测下限为152.3 ng/mL。结论:成功... 

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 GRP78蛋白的表达与纯化
            1.2.1. 1 GRP78蛋白表达
            1.2.1. 2 GRP78蛋白纯化
        1.2.2 抗GRP78多克隆抗体制备与纯化
        1.2.3 抗GRP78腹水型单克隆抗体制备与纯化
            1.2.3. 1 抗GRP78腹水型单克隆抗体的制备
            1.2.3. 2 抗GRP78腹水型单克隆抗体的纯化
        1.2.4 双抗夹心ELISA法检测系统的建立
        1.2.5 封闭条件及羊抗兔酶标二抗作用时间优化
        1.2.6 标准曲线制作及灵敏度的确定
        1.2.7 试剂盒的特异性检测
        1.2.8 回收率实验
        1.2.9 双夹心ELISA法的可重复性检测
2 结果
    2.1 GRP78重组蛋白原核表达纯化
    2.2 抗GRP78兔多抗与腹水型鼠单抗制备纯化
    2.3 抗GRP78抗体的鉴定
    2.4 双抗夹心ELISA法检测系统的建立
    2.5 双抗夹心ELISA法的优化
    2.6 建立标准曲线
    2.7 试剂盒的特异性检测
    2.8 可重复性检测
    2.9 血清中GRP78蛋白添加回收率检测
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]几种提纯鸭病毒性肝炎血清免疫球蛋白G方法的比较[J]. 马秀丽,冯涛,于可响,王春玲,宋敏训.  山东农业科学. 2007(01)



本文编号：3646936