利用CRISPR/Cas9技术构建人MPZL1基因敲除的SPC-A1稳定细胞株

发布时间：2022-07-03 12:16

　　PZR（Protein zero related）即髓鞘P0蛋白相关蛋白,由MPZL1基因编码,位于人常染色体1q24.1-24.2。PZR是一种高度保守的蛋白质,在多种细胞类型中均有表达,作为SHP-2的特异性锚定蛋白和生理底物,很可能会在某些SHP-2参与的信号通路中发挥重要作用。研究表明,PZR会对细胞的迁移和粘附产生影响,而且在NS/LS、HCC BCa（HER2+）等疾病中都存在PZR的异常表达。但是PZR的生物学功能和临床意义仍然不明确,还需进行深入研究。本文基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肺腺癌细胞SPC-A1中MPZL1基因。首先根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计特异性识别MPZL1基因第二个外显子相关序列的两个sgRNA,再分别与PX458和PX459载体相连构建重组真核表达质粒。经测序鉴定后,将两个重组质粒共转染至SPC-A1细胞中,用嘌呤霉素筛选稳定敲除MPZL1基因的细胞株。最后通过PCR、Western Blot和基因测序鉴定其基因型,实验结果表明我们成功构建了MPZL1基因敲除的SPC-A1稳定细胞株。此外,我们通过CCK-8、原位计数... 

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 PZR简介
        1.1.1 PZR的发现及结构特征
        1.1.2 PZR的生物学功能
        1.1.3 PZR与疾病
    1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术
        1.2.1 CRISPR/Cas系统组成
        1.2.2 CRISPR/Cas9作用原理
        1.2.3 CRISPR/Cas9技术应用
    1.3 本课题的研究内容及目的
第二章 MPZL1基因敲除SPC-A1稳定细胞株的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 主要试剂与检测试剂盒
        2.1.2 菌株、载体和细胞
        2.1.3 主要耗材与仪器设备
        2.1.4 主要溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞系的选择
        2.2.2 sgRNA序列设计
        2.2.3 MPZL1-sgRNA双链和线性PX458、PX459载体的构建
        2.2.4 重组质粒PX458-MPZL1-sgRNA1和PX459-MPZL1-sgRNA 2 的构建及鉴定
        2.2.5 SPC-A1细胞培养与重组质粒共转染
        2.2.6 稳定细胞株的单克隆筛选
        2.2.7 Western Blot鉴定
        2.2.8 PCR及基因测序分析
    2.3 实验结果及分析
        2.3.1 MPZL1基因编码蛋白在不同细胞系中的相对表达水平
        2.3.2 PX458-MPZL1-sgRNA1和PX459-MPZL1-sgRNA2重组质粒的构建
        2.3.3 Western Blot鉴定SPC-A1-MPZL1-KO稳定细胞株内MPZL1编码蛋白的表达
        2.3.4 SPC-A1-MPZL1-KO稳定细胞株的PCR及基因测序鉴定
    2.4 本章小结
第三章 MPZL1基因对SPC-A1细胞的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 主要试剂与检测试剂盒
        3.1.2 菌株、载体和细胞
        3.1.3 主要耗材与仪器设备
        3.1.4 主要溶液配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 CCK-8 细胞增殖实验
        3.2.2 细胞原位计数实验
        3.2.3 细胞划痕实验
        3.2.4 细胞悬滴聚集实验
        3.2.5 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 CCK-8 细胞增殖实验结果
        3.3.2 细胞原位计数实验结果
        3.3.3 细胞划痕实验结果
        3.3.4 细胞悬滴聚集实验结果
    3.4 本章小结
讨论
参考文献
作者简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑技术:进展与挑战[J]. 卢俊南,褚鑫,潘燕平,陈映羲,温栾,戴俊彪.  中国科学院院刊. 2018(11)
[2]CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J]. 郭全娟,韩秋菊,张建.  生物化学与生物物理进展. 2018(08)
[3]利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株[J]. 常丽贤,孙聪聪,陈晓娟,杨文钰,张家源,张英弛,袁卫平,竺晓凡.  生物工程学报. 2017(02)
[4]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰.  遗传. 2015(10)
[5]The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions[J]. QU CHENG KUI Department of Hematopoiesis, Jerome H. Holland Laboratory for the Biomedical Sciences, American Red Cross, Rockville, Department of Anatomy and Cell Biology, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, Washington DC.  Cell Research. 2000(04)



本文编号：3654824