沙眼衣原体质粒蛋白pORF5引起的宿主差异蛋白的筛选及功能初步研究

发布时间：2017-05-15 07:37

  本文关键词：沙眼衣原体质粒蛋白pORF5引起的宿主差异蛋白的筛选及功能初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)p ORF5(pgp3)是由质粒基因编码的唯一一种分泌到宿主细胞胞浆中的分泌性质粒蛋白,与毒力密切相关,但p ORF5在Ct致病过程中的分子机制和功能还不甚明了。本研究试图探讨在Ct致病过程中与质粒蛋白p ORF5相互作用的宿主蛋白及其功能,为深入研究Ct的致病机制提供实验依据。构建p ORF5基因慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装慢病毒颗粒,收集慢病毒后感染He La细胞,流式细胞技术多次分选筛选阳性细胞克隆,获得p ORF5基因稳定转染的He La细胞系(p ORF5-He La细胞系)和对照He La细胞系,实时定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting分别鉴定p ORF5的m RNA和蛋白表达水平。采用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)技术建立p ORF5-He La细胞系和对照He La细胞系的全细胞蛋白表达谱,构建差异蛋白表达数据库;q RT-PCR验证部分差异蛋白m RNA的表达水平。应用DAVID在线生物信息学分析软件、在线STRING软件分析和在线KEGG PATHWAY Database软件分析等生物信息学方法对差异蛋白进行GO(基因本体)分子功能注释、蛋白质相互作用及KEGG信号通路分析,预测差异表达蛋白生物学功能。构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)基因RNAi慢病毒表达载体,利用三质粒慢病毒包装系统生产sh RNA-HMGB1病毒,收集病毒上清,并感染He La细胞,建立稳定干扰HMGB1表达的p ORF5-He La细胞系及空白载体转染的对照细胞系;采用q RT-PCR和Western blotting检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3的表达;采用流式细胞仪检测检测细胞凋亡率和细胞周期。本实验研究结果如下:1.成功建立了稳定过表达p ORF5的He La细胞系和对照细胞系;2.采用i TRAQ标记结合2D LC-MS/MS质谱技术共鉴定了314个差异表达的宿主蛋白,其中159个蛋白表达上调,155个蛋白表达下调。GO功能注释显示:差异蛋白的功能主要涉及分子功能、细胞组分功能和生物学进程功能三方面。分子功能方面包括:①蛋白结合转录因子功能,如核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶Ⅱ激活因子p15等;②核酸结合转录因子功能,如高迁移率族蛋白B1、高迁移率族蛋白B2等。细胞组分功能方面包括:①参与细胞分裂增殖,如氯离子通道蛋白1、膜联蛋白A1等;②参与细胞连接,如α-辅肌动蛋白-4、整合蛋白α-6等。在生物学进程功能方面:部分差异蛋白参与细胞繁殖过程,如运铁蛋白受体蛋白-1、60S酸性核糖体蛋白P2等;部分差异蛋白参与细胞免疫反应过程,如补体C9、补体衰退加速因子等;部分差异蛋白参与细胞死亡,如角蛋白、抑制蛋白-1等。STRING软件分析结果显示:各差异表达蛋白之间存在着直接和间接的相互作用。KEGG通路分析结果显示:差异蛋白与多条信号通路相关,主要涉及了核糖体通路、剪接体通路、ECM受体相互作用通路、MAPK信号通路和p53信号通路等;3.q RT-PCR证实p ORF5-He La细胞中PARK7、HMGB1、HMGB2、HBA1和HIST1H1C表达上调,CDKN2A、SFN、KRT7、CLIC1表达下调,Western blotting进一步验证HMGB1和PARK7蛋白质在p ORF5-He La细胞表达水平升高,与蛋白质组学结果一致;4.与对照细胞比较,稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞的自噬蛋白Beclin-1和LC-3m RNA表达明显降低,分别降低了62%和89.8%。Western blotting结果显示,与对照细胞比较,稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞自噬相关蛋白Beclin-1明显下降;LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比率小于对照组,LC3-Ⅱ表达降低。流式细胞仪检测结果显示稳定干扰HMGB1的p ORF5-He La细胞的凋亡率明显增加,增加了18.84%;细胞周期也发生了改变,G2和S期细胞分别增加了4.44%和3.4%。本实验研究结果表明:1.成功构建p ORF5所引起的宿主差异表达蛋白数据库,鉴定到差异蛋白314个,其中上调159个,下调155个,与细胞免疫反应、生物调节、生物粘附有关;2.p ORF5可通过上调宿主蛋白HMGB1,诱导细胞自噬、抑制细胞凋亡。
【关键词】：沙眼衣原体 质粒蛋白p ORF5 同位素标记相对和绝对定量 高迁移率族蛋白B1
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R374
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 主要中英文缩写12-15
• 第1章 绪论15-19
• 第2章 实验材料19-25
• 2.1 主要仪器19-20
• 2.2 慢病毒载体、菌株及细胞株20
• 2.3 主要试剂盒20
• 2.4 主要试剂20-22
• 2.5 生物信息学软件22-23
• 2.6 其他23-25
• 第3章 实验方法25-43
• 3.1 p ORF5基因稳定过表达细胞系的建立25-28
• 3.2 p ORF5慢病毒的包装28-29
• 3.3 p ORF5慢病毒感染He La细胞29
• 3.4 q RT-PCR检测p ORF5基因的表达水平29-30
• 3.5 Western blotting检测p ORF5蛋白的表达30-32
• 3.6 i TRAQ蛋白质组学鉴定p ORF5稳转细胞组与对照组差异表达蛋白32-36
• 3.7 生物信息学分析36-37
• 3.8. q RT-PCR验证部分差异蛋白的m RNA表达37-38
• 3.9 Western blotting验证部分差异蛋白的表达38
• 3.10 HMGB1功能的初步研究38-41
• 3.11 数据处理与统计学分析41-43
• 第4章 实验结果43-63
• 4.1 p ORF5基因稳定过表达细胞系的建立43-47
• 4.2 i TRAQ蛋白质组学鉴定p ORF5稳转细胞组与对照组中差异表达蛋白47-55
• 4.3 q RT-PCR验证部分差异表达蛋白的m RNA表达水平55
• 4.4 Western blotting验证部分差异表达蛋白质的表达水平55-56
• 4.5 HMGB1功能的初步研究56-63
• 第5章 讨论63-67
• 第6章 结论67-69
• 参考文献69-73
• 文献综述73-79
• 参考文献76-79
• 作者攻读学位期间的科研成果79-81
• 本研究受以下基金资助81-83
• 致谢83

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本文编号：367133