恶性疟原虫exosome-like催化亚基的鉴定与降解特性分析

发布时间：2017-05-16 13:25

  本文关键词：恶性疟原虫exosome-like催化亚基的鉴定与降解特性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：真核生物外切体是一种进化保守的多亚基核酸外切酶复合体,一般由10-11个不同的蛋白亚基组成。它是真核生物中重要的3'→5'核糖核酸外切酶之一,参与了生物体内多种RNA分子的3'端加工和降解,对于生物体的正常生长发育和调控具有重要作用。恶性疟原虫属于原生生物,是恶性疟疾的病原体,给人类的健康带来极大的危害。然而目前关于恶性疟原虫RNA加工降解机制研究较少,更未见恶性疟原虫外切体的相关研究报道。这可能影响了人们对恶性疟原虫应对复杂生活史和宿主免疫压力的作用机制的全面解析。通过对恶性疟原虫3D7株蛋白质组进行生物信息学分析发现,在恶性疟原虫中可能也存在着一种类似外切复合体(exosome-like),该复合体至少由8个不同的亚基组成。结合功能域分析和其他研究报道筛选出四个催化亚基分别为Pf Rrp4、Pf Rrp41、Pf Dis3、和Pf Rrp6,同时选取Pf Rrp42亚基作为对照。以恶性疟原虫3D7株为研究对象,首先以丝氨酰t RNA合成酶基因作为内参基因,通过荧光定量PCR实验检测各亚基在虫体红内期的转录差异。通过构建重组表达载体,在大肠杆菌表达系统中分别表达纯化His-tag和GST-tag重组蛋白质。其中His-tag重组蛋白质用来免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。然后通过Western blot和间接免疫荧光实验对虫体中天然蛋白质的表达和定位进行分析。而纯化得到的GST-tag重组蛋白质则用于各亚基的体外RNA降解特性分析。荧光定量PCR实验表明恶性疟原虫exosome-like催化亚基在红内期转录差异较大,但各亚基在红内期全程转录平稳,这说明各亚基对于虫体的生长发育必不可少。Western blot和间接免疫荧光实验显示各亚基在虫体内均为全长表达,且均表达于虫体的细胞质中,临近于核膜的周围。体外RNA降解实验表明Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6亚基均具有单链RNA酶活性,而Pf Rr4和Pf Rrp42亚基对单、双链RNA均无降解能力。在降解单链RNA时,Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性均为二价金属离子依赖性,且在一定金属离子浓度范围内,其降解活性与离子浓度成反比。不同的是,Pf Rrp41亚基在降解单链RNA时不需要钾离子的参与,而Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性还具有钾离子依赖性,且在100 m M钾离子浓度时达到活性高峰。通过本研究表明,在恶性疟原虫中也存在一种exosome-like多亚基复合体,参与虫体RNA的加工和降解。该复合体的Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6三个亚基为催化亚基,具有单链RNA酶活性,且均表达于虫体细胞质中。这将为进一步解析虫体外切体的结构和功能奠定基础,为解析虫体内RNA分子的加工降解机制提供新的视野。
【关键词】：恶性疟原虫 exosome-like 催化亚基 RNA降解
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩写词表10-11
• 引言11-13
• 第一篇 文献综述13-22
• 第1章 真核生物外切体概述13-22
• 1 真核生物外切体的组成与结构13-19
• 1.1 外切体核心结构Exo914-16
• 1.2 RRP44/Dis3亚基16-17
• 1.3 RRP6亚基17
• 1.4 真核生物外切体的亚基同系物及其存在形式17-19
• 2 真核生物外切体的功能19-22
• 第二篇 研究内容22-71
• 第1章 生物信息学分析22-30
• 1.1 材料22-23
• 1.2 方法23-24
• 1.3 结果24-27
• 1.4 讨论27-28
• 1.5 小结28-30
• 第2章 荧光定量PCR检测目的催化亚基在恶性疟原虫 3D7株红内期的转录差异30-38
• 2.1 材料30-32
• 2.2 方法32-35
• 2.3 结果35-36
• 2.4 讨论36-37
• 2.5 小结37-38
• 第3章 恶性疟原虫exosome-like催化亚基重组蛋白质的原核表达、纯化以及多克隆抗体的制备38-57
• 3.1 材料38-42
• 3.2 方法42-49
• 3.3 结果49-55
• 3.4 讨论55-56
• 3.5 小结56-57
• 第4章 目的亚基的天然蛋白质鉴定与亚细胞定位分析57-63
• 4.1 材料57-58
• 4.2 方法58-59
• 4.3 结果59-61
• 4.4 讨论61-62
• 4.5 小结62-63
• 第5章 恶性疟原虫exosome-like催化亚基的体外RNA降解特性分析63-71
• 5.1 材料63-64
• 5.2 方法64-66
• 5.3 结果66-69
• 5.4 讨论69-70
• 5.5 小结70-71
• 结论71-72
• 参考文献72-79
• 攻读硕士期间发表的学术论文79-80
• 导师简介80-81
• 作者简介81-82
• 致谢82

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