IRAK2-Smurf1信号轴在内质网应激中的功能研究

发布时间：2017-05-17 18:26

  本文关键词：IRAK2-Smurf1信号轴在内质网应激中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：内质网是蛋白质的修饰、加工、合成以及肽链的折叠和组装运输的主要场所,内质网通过对蛋白质的加工和修饰积极的参与到诸如细胞凋亡、调节血糖的浓度、钙离子平衡的调节、合成膜脂以及合成激素等多种生理活动当中。内质网应激是指当内质网内合成的蛋白质得不到及时的转运、非折叠或错误折叠的蛋白在内质网中大量的积聚,又或者受到饥饿、缺氧、药物影响、钙离子平衡被打破等各种因素导致的内质网生理功能受损。目前已经证实内质网应激与阿尔茨海默病、糖尿病、肾小管损伤、帕金森氏病、肝脏病毒性损伤和酒精性损伤等众多疾病的发生发展有关。内质网应激促进细胞凋亡的机制主要包括未折叠蛋白反应和钙离子信号等几大类。当细胞内钙离子平衡被严重破坏时,细胞质中依赖钙离子的钙蛋白酶(calpain)被激活并寻找到内质网膜上的Procaspasel2,将其剪切并活化,随后通过一系列信号传导最终导致细胞凋亡程序启动：当内质网的合成、折叠、修饰蛋白质功能受损而引起大量非折叠和错误折叠的蛋白质在内质网内积聚,内质网会启动一系列补救措施试图纠正这些错误蛋白质,最终会导致内质网合成功能下降、降解能力增强、发生细胞凋亡等一系列后续反应,这些由于积聚在内质网内的未经修饰的蛋白和错误折叠的蛋白多引发的反应就是未折叠蛋白反应(UPR)。而当发生未折叠蛋白反应时,内质网可以通过激活IRE1、ATF6和PERK三条信号传导通路,此时的内质网会自我保护性的减少新蛋白的翻译及生成、加强对错误折叠蛋白的降解来使自己重新恢复生理平衡,但过度的激活这三条通路都会不可避免的导致细胞启动凋亡程序泛素化是指在酶促级联反应的作用下,泛素分子标记在底物蛋白的过程。泛素化参与了细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、转录调节、损伤修复、炎症免疫等诸多生命活动。泛素一蛋白酶体途径是泛素发挥上述蛋白质降解功能的主要途径,主要由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2以及泛素蛋白连接酶E3、去泛素化酶、26S蛋白酶体构成。机体内的E3主要分为两大类：RING类E3以及HECT类E3,而目前对HECT类E3研究较多的是Nedd4家族。Nedd4家族在TNF-α、TGF-β以及BMP等多条信号传导通路中起着不可或缺的调控功能。Smad泛素化调节因子1(Smurf1)是Nedd4家族中的一员,深入研究Smurf1后发现其不光在微观层面对细胞生长和形态学改变、细胞迁移、细胞极性以及细胞的自我吞噬功能中起着重要的作用并且在骨形成、胚胎发育以及肿瘤发生发展等宏观生物学过程中发挥着重要的生理学功能。2005年时,一篇发表在Science杂志上的研究中,作者根据从大规模筛选结果,发现野生型和酶活突变型Smurf1与IRAK2相互作用预测分值很高,提示我们IRAK2可能和Smurf1以及TGF-B通路存在着交互作用,但究竟其具有何种生理影响等科学问题均未给与解答。白细胞介素1受体相关激酶(IRAKs)是Toll样受体信号途径中的关键调控分子。IRAK家族包括4个成员：IRAK1、IRAK2、IRAK3 (IRAK-M) 以及 IRAK4。家族成员都含有一个死亡结构域,该结构与、域可以与MyD88死亡结构域相互作用的。IRAK2广泛存在于各种人体组织中。在Toll样受体信号通路中,发挥着承上启下调控信号传递的作用,是固有免疫系统产生免疫反应免疫应答不可缺少的关键激酶。我们对IRAK2和Smurf1之间的相互作用、作用方式和意义进行了深入细致的研究。首先我们构建了人源Smurf1和IRAK2的真核表达载体,并且进行了免疫共沉淀相互作用实验。发现Smurf1确实可以和IRAK2进行相互作用；随后通过不同种属来源的Smurf1和IRAK2的内源抗体检测,发现smurf1和IRAK2在内源条件下也是存在相互作用的；并通过共定位和构建Smurf1截短体证实了在细胞中IRAK2与Smurf1是在内质网这一结构上发生相互作用的；随后通过相互作用区域实验证实Smurf1与IRAK2的相互作用主要是通过HECT结构域来完成的。之后我们通过过量表达实验却发现虽然IRAK2对Smurf1的蛋白水平负调依赖于蛋白酶体途径,但Smurf1并不是IRAK2的泛素连接酶E3,我们通过用慢病毒载体包装病毒后构建稳定株也显示敲低IRAK2后Smurf1蛋白水平上调,说明IRAK2对Smurf1的蛋白水平具有负调节效应,于是我们构建了IRAK2缺失酶活催化结构域的截短体,并进行了磷酸化水平检测。发现IRAK2可以明显的促进smurf1苏氨酸的磷酸化,并且的确磷酸化发生在HECT结构域中的Thr114, Thr128, Thr437三个位点的苏氨酸。结合共定位实验的结果,我们设想IRAK2对Smurf1的负调控功能可能与内质网的相关功能有联系。于是检测了毒胡萝卜素(Thapsigargin)刺激情况下的IRAK2介导的ER stress通路和smurf1介导的ER stress通路的响应情况,发现确实IRAK2和Smurf1呈现负相关：随后我们再次检测了敲低IRAK2细胞株中Smurf1介导内质网应激的信号通路动态变化,结果显示敲低IRAK2的细胞株,Smurf1下游的WFS1以及ATF6的蛋白含量变化,证明IRAK2确实通过Smurf1调节内质网网应激信号通路。
【关键词】：内质网应激 磷酸化 IRAK2 Smurf1
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文缩略语对照表12-13
• 第一章 前言13-17
• 第一节 泛素—蛋白酶体途径13-15
• 第二节 HECT类泛素连接酶及其成员Smurf1的结构15-17
• 第二章 IRAK-2与泛素连接酶Smurf 1之间的相互作用17-27
• 第一节 背景资料17-21
• 第二节 材料与方法21-22
• 第三节 结果与讨论22-27
• 第三章 IRAK-2对泛素连接酶Smurf 1在内质网应激中的调控27-36
• 第一节 背景资料27-31
• 第二节 材料与方法31
• 第三节 结果与讨论31-36
• 第四章 讨论36-39
• 参考文献39-45
• 附录45-56
• 附录1 实验常用方法详细流程步骤45-50
• 附录2 引物的设计与酶切位点设计50-51
• 附录3 实验主要使用材料来源、试剂配制及常用仪器设备51-56
• 文献综述56-70
• 参考文献66-70
• 攻读学位期间发表文章情况70-71
• 致谢71-72

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1 刘兢文;IRAK2-Smurf1信号轴在内质网应激中的功能研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

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本文编号：374185