利用同源重组构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体

发布时间：2023-02-26 08:44

　　目的:用同源重组的方法构建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒过表达载体,为进一步研究DGKγ在神经上皮细胞的作用机制提供实验基础。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的cDNA作为模板,通过PCR反应分别扩增大鼠DGKγ基因CDS区5’端1029bp和3’端1362bp作为同源重组片段,片段一和片段二之间有24bp重叠序列,设计引物时在片段一上游引物的5’端和片段二下游引物的5’端分别引入15-25bp与线性化载体末端相同的碱基序列;限制性内切酶酶切穿梭质粒使线性化,利用同源重组技术将扩增得到的两个同源重组片段与线性化载体进行定向连接,重组产物转化感受态细胞,用氨苄青霉素筛选阳性单克隆,进行菌液培养;随机选取两个阳性单克隆的菌液,提取质粒进行PCR扩增及扩增产物送测序鉴定,鉴定正确的质粒命名为CMV-rat DGKγ-GFP;将CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒质粒载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以CMV-GFP空载体作为对照;收集慢病毒毒液感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达,用嘌呤霉素筛选GFP阳性细胞,收集细胞应用实时荧...

【文章页数】：37 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 目的片段扩增
        1.2.2 穿梭质粒构建
        1.2.3 293T细胞培养
        1.2.4 慢病毒包装
        1.2.5 慢病毒感染
        1.2.6 荧光定量PCR
        1.2.7 细胞蛋白的提取
        1.2.8 Western blotting
        1.2.9 统计方法
2 结果
    2.1 大鼠DGKγ基因CDS区和两个同源重组片段的扩增
    2.2 CMV-rat DGKγ-GFP载体构建
    2.3 CMV-rat DGKγ-GFP载体慢病毒包装
    2.4 慢病毒CMV-rat DGKγ-GFP在293T细胞中的表达
3 讨论
4 结论
参考文献
综述 同源重组技术构建载体的研究
    参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3750217