结核分枝杆菌cAMP诱导基因Rv1265在胞内存活中的作用与分子机理

发布时间：2017-05-20 00:13

  本文关键词：结核分枝杆菌cAMP诱导基因Rv1265在胞内存活中的作用与分子机理，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：据2013World Health Organization Tuberculosis Data and Statistics报道,结核病每年导致1.3million死亡,新增8.6 million感染病例。由于药物的广泛滥用及乱用,使得结核病死灰复燃,严重危害着人类的健康,尤其是与HIV免疫缺陷病人共感染。多重耐药菌(mutiple-drug resistance)和广泛耐药菌(extensive-drug resistance)的出现使得结核病的治疗更加困难。因此寻找结核分枝杆菌的新的药物靶标,筛选并开发新型抗结核药物。目前结核分枝杆菌存在许多功能未知的保守蛋白,而这些蛋白对于结核分枝杆菌在宿主中的存活是否存在一定关联,这些都需要做进一步的探讨。因此本文主要以耻垢分枝杆菌为模型,探索cAMP应答基因rv1265在结核分枝杆菌毒力中的作用。本研究成功构建了重组质粒pALACE-Rv1265,将其电转到耻垢分枝杆菌后通过抗生素筛选和菌液PCR的方法鉴定重组菌株Ms_Rv1265构建成功。以实验室现存的空载菌株Ms_vector为对照,western blotting成功检测到Ms_Rv1265菌株中带有His标签的Rv1265蛋白表达,而空载菌(Ms_Vec)在相应的位置上没有条带。利用96孔板检测Rv1265的过表达菌株对临床上常用的抗结核药物的耐受情况,发现与Ms_Vec相比Ms_Rv1265对抗生素的耐受性并没有影响。生长曲线测定发现Ms_Rv1265和Ms_Vec的生长没有差异,说明Rv1265的过表达不会影响耻垢分枝杆菌的生长。细胞亚定位发现Rv1265蛋白定位在重组菌的细胞壁和细胞质中推测该蛋白可能会改变重组菌的细胞壁性质。因此我们提取Ms_Rv1265和Ms_Vec的脂肪酸,发现重组菌细胞壁的脂肪酸含量明显高于空载菌,尤其是C10：0,MeC13:0, MeC14:0, C15:0, MeC15:0, C16:1We7(c), MeC16:0,3MeC16:0, C24:1W9(c)和C26：0的含量显著性上调,据此我们推测Rv1265可能参与了耻垢分枝杆菌脂肪酸的合成。C26：0是分枝菌酸高温分解的产物之一,而重组菌中C26：0的增多也可能是因为重组菌中分枝菌酸的含量增多引起的。体外模拟重组菌Ms_Rv1265和Ms Vec在表面活性物质SDS和不同酸性条件下的存活,发现重组菌在0.1% SDS处理下具有较强的存活率,并且相对于空载菌具有显著性差异。在PH=3的7H9培养基里培养时发现与Ms_Vec相比,Ms_Rv1265具有较强的存活率,而在PH=5的条件下,两者没有显著性差异。为了进一步探索Rv1265蛋白的毒力作用,利用Ms_Rv1265和Ms_Vec侵染THP-1细胞和Raw264.7细胞,发现Ms_Rv1265在巨噬细胞内的存活能力相对于Ms_Vec具有显著性提高,LDH释放量检测发现与Ms_Vec相比Ms_Rv1265可以促进THP-1巨噬细胞的裂解。同时提取Raw264.7和THP-1细胞的总RNA,检测相关的细胞因子IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12P40和TNF-a,以及炎症相关的caspase-1和促凋亡因子bcl-rambo的转录水平。发现与Ms_Vec相比Ms_Rv1265侵染后在Raw264.7和THP-1细胞中细胞因子IL-1β,IL-12P40, IL-10和IL-6均上调表达。利用特异性的信号通路抑制剂处理侵染了Ms_Rv1265和Ms_Vec的细胞THP-1,发现NF-κB和1/2ERK途径对于特异性诱导IL-1β, IL-12P40, IL-10和IL-6的上调表达具有非常重要的作用。综上所述,本文主要研究了cAMP应答基因Rv1265的功能,发现与空载菌相比,过表达菌株Ms_Rv1265对胞外压力的耐受能力增强,并通过干扰宿主细胞的细胞因子表达来增强其在巨噬细胞的存活。此外,Rv1265的过表达改变了耻垢分枝杆菌中细胞壁的脂肪酸成分。以上结果表明Rv1265极有可能是结核分枝杆菌的毒力基因,这将为研究结核分枝杆菌与宿主相互作用网络提供了线索。
【关键词】：结核分枝杆菌 cAMP Rv1265 巨噬细胞 细胞因子
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第1章 综述13-21
• 1.1 cAMP的合成13-14
• 1.2 腺苷酸环化酶14
• 1.3 磷酸二酯酶14-15
• 1.4 cAMP效应蛋白15
• 1.5 cAMP应答转录因子15-16
• 1.6 细菌致病菌中cAMP的作用16-21
• 1.6.1 致病细菌的cAMP信号17-19
• 1.6.2 致病真菌中cAMP信号19
• 1.6.3 寄生原虫中cAMP信号19-21
• 第2章 前言21-23
• 第3章 实验材料和方法23-39
• 3.1 实验材料23-25
• 3.1.1 实验菌株,载体和细胞23
• 3.1.2 所用培养基及培养条件23-24
• 3.1.3 主要试剂24-25
• 3.1.4 主要仪器25
• 3.2 实验方法25-39
• 3.2.1 结核分枝杆菌Rv1265基因的扩增25-26
• 3.2.2 Rv1265 PCR产物的回收26
• 3.2.3 制备大肠杆菌感受态细胞26
• 3.2.4 大肠杆菌的转化26
• 3.2.5 Rv1265基因与T载质粒的构建26-27
• 3.2.6 重组质粒的提取27
• 3.2.7 Rv1265+pALACE重组质粒的构建27-28
• 3.2.8 Rv1265重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化28-29
• 3.2.9 Rv1265重组耻垢分枝杆菌的构建29-30
• 3.2.10 重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达验证30-31
• 3.2.11 Rv1265重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位分析31
• 3.2.12 重组耻垢分枝杆菌Ms Rv1265对SDS耐受的影响31
• 3.2.13 体外模拟重组耻垢分枝杆菌Ms Rv1265在不同PH条件下的存活率31-32
• 3.2.14 重组耻垢分枝杆菌脂肪酸提取和测定32
• 3.2.15 重组菌生长曲线的测定32-33
• 3.2.16 重组菌侵染巨噬细胞存活率检测33-34
• 3.2.17 定量RT-PCR检测重组菌侵染Raw264.7和THP-1巨噬细胞后相关因子转录水平34-36
• 3.2.18 LDH测定36
• 3.2.19 细胞信号通路抑制剂处理细胞36
• 3.2.20 耻垢分枝杆菌ΔMSMEG5010基因的敲除36-38
• 3.2.21 数据处理38-39
• 第4章 结果与分析39-55
• 4.1 成功构建重组质粒Rv1265+pALACE39-40
• 4.2 构建重组耻垢分枝杆菌Ms_Rv126540
• 4.3 Rv1265蛋白在大肠杆菌BL-21中成功表达40-41
• 4.4 Rv1265在耻垢分枝杆菌Ms_Rv1265中成功表达41
• 4.5 Rv1265定位于细胞壁和细胞质41-42
• 4.6 Rv1265的过表达不影响菌株的生长42-43
• 4.7 Rv1265的过表达增强了菌株在酸性条件下的存活率43
• 4.8 Rv1265参与耻垢分枝杆菌脂肪酸代谢43-45
• 4.9 Rv1265可以增强重组菌对于表面活性物质SDS的耐受45-46
• 4.10 重组菌Ms_Rv1265在巨噬细胞存活的影响46-48
• 4.10.1 Rv1265有利于重组菌在THP-1细胞的存活,并且可以促进细胞裂解46-47
• 4.10.2 重组菌Ms Rv1265增强在Raw264.7巨噬细胞内的存活47-48
• 4.11 Rv1265在耻垢分枝杆菌的过表达会促进THP-1细胞死亡48
• 4.12 Rv1265的过表达可以特异性诱导THP-1细胞免疫调节细胞因子的表达48-49
• 4.13 重组菌Ms_Rv1265特异性诱导Raw264.7的免疫调控因子IL-10,IL-12和IL-1β和IL-6上调表达49-51
• 4.14 Ms_Rv1265通过NF-B和ERK1/2通路调控IL-1β,IL-10,IL-12P40,IL-651-52
• 4.15 构建耻垢分枝杆菌同源基因MSMEG5010的敲除菌株52-53
• 4.16 △MS5010对诺氟沙星敏感53-55
• 第5章 结论与展望55-59
• 5.1 实验结论55
• 5.2 讨论与分析55-57
• 5.3 展望57-59
• 参考文献59-65
• 致谢65-67
• 在学期间所发表的文章67

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1 罗红萍;结核分枝杆菌cAMP诱导基因Rv1265在胞内存活中的作用与分子机理[D];西南大学;2015年

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本文编号：380274