6-羟基-1-氢-吲唑对MPTP帕金森病模型小鼠的保护作用

发布时间：2017-05-20 16:15

  本文关键词：6-羟基-1-氢-吲唑对MPTP帕金森病模型小鼠的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's Disease)是以黑质多巴胺能神经元丢失为病理特征的神经退行性疾病,60岁以上的老年人发病率可达1%,临床症状主要有静止性震颤、肌肉僵直、运动减少等,患者丧失随意运动的能力,病情严重则可产生认知障碍,严重影响了老年人的生活质量。截至目前,PD的病因尚未明确,也还没有一种药物或者方法能有效延缓和控制病情,探讨PD具体的病理机制和治疗方法成为亟待解决的研究课题。据报道,PD的病理机制与环境情况、遗传、年龄、细胞的凋亡、自身的免疫、氧化应激、兴奋性神经毒素等相关,其中与神经元生长发育密切相关的tau蛋白异常磷酸化引起了人们的关注。tau蛋白位于神经细胞的胞质,主要集中分布在轴突和树突的生长点,因其与神经细胞的发育、细胞的形态、物质运载、信号转导等关系密切,使得tau蛋白成为神经退行性疾病等有关研究范畴的热门蛋白分子。tau蛋白的异常变化如过磷酸化、糖基化等将可导致tau或其他某些神经退行性疾病有关蛋白质的异常折叠、分子聚集,再沉积在神经细胞内,导致细胞功能障碍以及变性和死亡。已经发现,多条信号传导通路,如c-Jun氨基末端激酶通路、p53的激活、细胞周期再激活、GSK-3β激活、CDK5激活以及通过Bcl-2家族蛋白的信号通路等介导了PD黑质多巴胺神经元凋亡,而tau蛋白是上述诸通路中关键激酶的共同底物,其在PD患者和动物模型中均表现为过度磷酸化,因此,调节tau蛋白的功能有望为PD的治疗提供新思路。tau蛋白的功能主要依其磷酸化水平而变化,若tau蛋白磷酸化水平过高,其稳定微管和支持神经元生长与发育的功能将受损。体内磷酸化tau蛋白的激酶众多,其中最重要的两个激酶是：糖原合成激酶3 (GSK-3β)和细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK5),因此,有望通过调节这两个激酶的活性降低tau蛋白过高的磷酸化水平,以达到保护神经元的目的。本课题前期研究已经发现,在使用MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)诱发人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)凋亡所建立的PD细胞模型试验中,6-羟基-1-氢-吲唑可同时抑制这两个激酶的活性,降低tau蛋白的磷酸化水平,提高了SH-SY5Y细胞的存活率。尽管我们前期的体外实验已充分证实6-羟基-1-氢-吲唑保护多巴胺能神经元的机制为抑制GSK-3β和CDK5的活性,下调tau蛋白的磷酸化水平,但是尚未在体内实验证实该化合物的作用及机制。在本课题实验中,我们使用MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)大剂量给药法建立PD的动物模型,探讨6-羟基-1-氢-吲唑在动物体内是否仍可使tau蛋白的磷酸化水平降低和保护多巴胺能神经元。将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、MPTP组、MPTP+低浓度药物组、MPTP+高浓度药物组,每组10只。记录小鼠腹腔注射MPTP后出现PD症状的潜伏期以及持续时间。给药适宜天数后,使用Western blot法、ABC-DAB染色法、荧光双染色法、行为实验法和HPLC法分别检测各组小鼠中脑部位的酪氨酸羟化酶(TH)含量、黑质多巴胺能神经元的存活情况、多巴胺能神经元内tau蛋白的磷酸化水平、行为学异常情况和纹状体多巴胺含量。通过以上各项指标的检测明确了在使用MPTP建立的PD C57BL/6小鼠体内,6-羟基-1-氢-吲唑可抑制tau蛋白的过磷酸化,保护黑质多巴胺能神经元。方法1. MPTP腹腔注射建立PD动物模型选取12周龄、雄性的C57BL/6小鼠40只,随机分为空白对照(control)组、MPTP(M)组、MPTP+2 mg/kg 6-羟基-1-氢-吲唑(低剂量)组、MPTP+4 mg/kg 6-羟基-1-氢-吲唑(高剂量)组。实验第一天,低剂量组和高剂量组小鼠分别腹腔注射2 mg/kg、4mg/kg 6-羟基-1-氢-吲唑,空白组和MPTP组小鼠均腹腔注射等容积含3%DMSO的生理盐水；第二天低剂量组和高剂量组先腹腔注射6-羟基-1-氢-吲唑,其余组腹腔注射等容积含3%DMSO的生理盐水。30 min后低剂量组、高剂量组和M组均腹腔注射30 mg/kg MPTP,空白组腹腔注射等容量的生理盐水,连续5天(共6天)。2.小鼠PD症状潜伏期和持续时间测定在MPTP注射的第二天,每只小鼠MPTP注射后仔细观察并记录实验动物出现震颤麻痹症状的潜伏期和维持时间。潜伏期：从腹腔注射MPTP完毕至震颤麻痹症状出现的时间；维持时间：从震颤麻痹症状开始出现至震颤麻痹症状完全消失时的时间。比较每组小鼠注射MPTP后震颤麻痹症状的潜伏期和持续时间,探讨6-羟基-1-氢-吲唑是否可改善小鼠震颤麻痹症状。3.小鼠黑质多巴胺能神经元检测MPTP末次注射后第七天,切取黑质致密部的351μm脑片。TBS/Triton (TritonX-100的含量为0.1%)漂洗后,用新鲜制备的含0.3 %H202的TBS处理脑片30分钟。室温下,用TBS/Triton漂洗脑片两次,每次5 min;然后用3%goat血清(TBS/Triton配制)封闭脑片上的非特异结合位点,室温1小时。在TH抗体4℃孵育过夜后(注意保湿),TBS/Triton室温洗两次,每次5 min。室温下,用生物素标记的goat抗rabbit二抗孵育脑片2小时；期间配制ABC试剂混合溶液,至少在室温下静置15 min。用TBS/Triton漂洗两次,每次5 min后,在ABC混合溶液中室温孵育脑片1小时；用TBS/Triton洗两次,每次5 mmin,最后在DAB中孵育脑片直到利用光学显微镜判断染色是理想的(一般2-5分钟)。用TBS漂洗脑片后,把脑片置于硅化玻片上,4℃过夜。第二天,把脑片按先后顺序浸入50%,70%,80%,90%,95%和100%的乙醇中脱水,时间均为2 min;然后是乙醇/二甲苯混合溶液(1：1混合)浸泡2min；100%二甲苯浸泡透明3 min；最后以中性树脂封片,光学显微镜下观察分析拍照,室温保存。4.小鼠中脑组织TH蛋白含量的测定MPTP末次注射后第七天,各实验组取小鼠一只,颈椎脱臼致死,迅速分离出腹侧中脑,称重,按500 μl/50 mg的比例加入冷Tris裂解缓冲液,低温匀浆(冰浴),超声破碎,12000 rpm 4℃离心30 min,取上层清液,弃沉淀,BCA法测定蛋白含量,-20℃保存,待Western blot检测TH蛋白含量。5.小鼠行为学实验最后一次MPTP注射后的第十天观察小鼠行为学改变。爬杆试验(pole test):将一个软木小球(直径为2.5厘米)固定在一根木杆(长为50厘米,直径为1厘米)顶端,小球缠上纱布(防打滑),然后将各组小鼠置于小球上,再记录下列3个时间：小鼠在顶球上所停留的时间；小鼠爬完杆子的上半部分所耗费的时间；小鼠爬完杆子的下半部分所耗费的时间。最后根据如下标准评分：能在3秒内完成以上任一动作的小鼠记3分；能在6秒内完成的小鼠记2分；若超过6秒的记1分。最后计算三项累计得分情况,并作统计学分析。悬挂实验(traction test):将待测小鼠两前爪悬挂在一根水平电线上,若小鼠用两后爪抓住电线则记3分；如用一后爪抓住电线则记2分。若小鼠两只后爪均抓不住电线则记1分,然后记录各组小鼠得分,最后进行统计学分析。6.高效液相色谱法测定小鼠纹状体多巴胺含量MPTP末次注射后第十天,各实验组小鼠在完成行为学测试后,取双侧纹状体称重后,置-70℃保存。检测当日,将0.5ml高氯酸提取液(溶液成分：0.1 mol/L高氯酸,0.1%半胱氨酸)加入每一样品内,在冰浴中进行组织匀浆,18000 rpm4℃离心20 min,取上清液25-100μl进行分析。色谱条件：510高压泵(WATERS公司),7125进样器,HP1049A电化学检测器,BDS C18色谱柱(大连依利特公司),规格4.6×250 mm,5μm粒径。缓冲液：3 mmol/L庚烷璜酸钠,100 mmol/L醋酸钠,85 mmol/L柠檬酸,0.2 mmol/L EDTA, PH4.0。流动相由缓冲液和甲醇(90：10 v/v)组成。流速：1.0 ml/min,柱温：40℃。定性分析：以样品的保留时间与标准物保留时间对照定性。定量方法：以DHBA为内标物,以样品峰面积与内标峰面积的比值进行定量分析。7.小鼠黑质多巴胺能神经元内tau蛋白磷酸化水平检测实验第四天,MPTP注射后6小时,取脑行经黑质致密部的10μm切片做TH抗体和p-tau抗体的荧光双染色实验。切片置于24孔板内,用TBS/Triton洗一次后,用溶于TBS/Triton的3%驴血清封闭非特异结合位点室温1小时。用含3%BSA的TBS溶液稀释的第一个一抗,即特异性TH抗体,在4℃下孵育脑片过夜。第二天,用TBS/Triton漂洗两次,每次5 min,然后用含3%BSA的TBS液稀释的第二个一抗p-tau,37℃孵育2小时。室温下用TBS/Triton洗两次,每次5 min,然后用TBS洗5 min用含1%BSA的TBS以1：200的稀释度稀释并混合两种荧光二抗,室温下孵育脑片1小时。孵育盒用锡箔覆盖避光。TBS漂洗两次,每次10 min后,脑片置于PBS溶液中悬浮贴片。用抗荧光淬灭封片剂把脑片制成标本。荧光显微镜下观察分析拍照,最后置于4℃避光保存。8.统计学处理所有统计分析均用SPSS统计软件分析。数据均采用均数±标准误(mean± S.E.M)表示,采用LSD's t检验,p0.05认为有统计学意义。多组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)。结果1.6-羟基-1-氢-吲唑对MPTP PD模型小鼠产生的震颤麻痹症状潜伏期和持续期的影响每次腹腔注射MPTP完成后,MPTP组小鼠均出现全身震颤,行动迟缓,前肢向前伸展,两后肢屈蹲,弓背竖毛,饮水和进食困难；且随着给药次数的增加,症状逐渐加重,该组小鼠PD震颤麻痹症状的潜伏期和持续时间分别为1.89±0.08 min和25.58±0.51 min (P0.01)。给予6-羟基-1-氢-吲唑的两组小鼠注射MPTP后的震颤麻痹症状明显减轻,表现在症状出现的潜伏期延长,低剂量组和高剂量组分别为3.97±0.15 min和3.51±0.09 min (P0.01);症状的维持时间缩短,低剂量组和高剂量组分别为16.85±0.72 min和16.48±0.45 min(P0.01)。空白组小鼠活动正常,未出现上述任何症状。2.黑质多巴胺能神经元存活情况在MPTP末次注射后第七天,使用ABC法检测各组小鼠黑质内残存的多巴胺能神经元数目。统计分析结果显示,MPTP组小鼠双侧黑质部位的多巴胺能神经元大量丢失,残留数量仅为空白对照组小鼠的36.65%(P0.01)。而6-羟基-1-氢-吲唑可抑制因MPTP毒性所引起的多巴胺能神经元凋亡。在低剂量组,小鼠黑质多巴胺能神经元残留数量明显较MPTP组小鼠多,残留量为空白对照组的78.61%(P0.01)。在高剂量组,小鼠黑质多巴胺能神经元数量已接近空白组,残留数量为空白对照组的93.63%(P0.01)。3. western blotting检测小鼠中脑TH蛋白含量在MPTP末次注射后第七天,western blotting法检测各组小鼠中脑部位TH蛋白的含量,结果显示：MPTP可使小鼠中脑的TH蛋白水平显著降低,MPTP组小鼠中脑TH蛋白的表达量仅为空白对照组的45%(P0.01)。但是,6-羟基-1-氢-吲唑可明显升高因MPTP毒性降低的TH含量,低剂量组小鼠中脑TH含量为空白对照组的60%(P0.01),高剂量组小鼠中脑TH含量可达空白组的88%(P0.01)。4.各组小鼠行为学实验在MPTP末次注射后的第十天,对各组小鼠实施行为学检测。在爬杆实验中,MPTP组小鼠爬完上半部分和下半部分所用时间明显比空白对照组长,空白对照组和MPTP组小鼠得分分别为8.0±0.3和5.1±0.4。低剂量组和高剂量组小鼠完成爬杆实验所用时间均明显比MPTP组小鼠少,得分分别为7.1±0.6和7.1±0.6(P0.05)。在悬挂实验中,空白对照组小鼠用四肢抓住电线,得分为2.6±0.1(P0.05)；而MPTP组小鼠却只能用前爪抓住电线,后爪无力,得分为1.7±0.1(P0.05)；6-羟基-1-氢-吲唑处理的低剂量组和高剂量组小鼠虽然有的后爪仍然运动受阻,但至少可以用一只后爪抓住电线,得分分别为2.4±0.1和2.2±0.2(P0.05)。5.小鼠纹状体多巴胺浓度在MPTP末次注射后的第十天,高效液相色谱法检测各组小鼠纹状体内的多巴胺浓度,结果显示：与空白对照组的纹状体多巴胺浓度(12.54±0.27 ng/mg)相比,MPTP组的多巴胺浓度显著降低(P0.01),为2.75±0.16 ng/mg;但是6-羟基-1-氢-吲唑处理后的小鼠纹状体多巴胺浓度明显比MPTP组高,低剂量组和高剂量组小鼠纹状体多巴胺浓度分别为4.63±0.56和4.14±0.13 ng/mg (P0.01).6.黑质多巴胺能神经元内tau蛋白磷酸化水平利用TH抗体和磷酸化tau蛋白(p-tau(Ser396))抗体进行免疫荧光双染色实验,检测MPTP处理2天后的黑质多巴胺能神经元内tau蛋白的磷酸化水平,进行免疫荧光双染色实验,免疫组织化学的荧光双染色实验结果显示,被荧光素FITC标记的二抗结合的多巴胺能神经元呈绿色,被荧光素Cy-3标记的二抗结合的多巴胺能神经元呈红色,两荧光图结合后,呈橘红色的细胞说明多巴胺能神经元内磷酸化tau(Ser396)表达高,仍然呈绿色的细胞说明多巴胺能神经元内磷酸化tau(Ser396)表达低。MPTP组小鼠黑质多巴胺能神经元包浆内有大量的p-tau(Ser396)表达,荧光双染呈橘红色细胞数目较多,阳性率为52.19%(P0.01)。而6-羟基-1-氢-吲唑可抑制MPTP升高的p-tau(Ser396),使低剂量组和高剂量组小鼠黑质多巴胺能神经元内的tau蛋白磷酸化水平降低,荧光双染阳性细胞数目减少,阳性率分别为21.17%和17.85%(P0.01)。空白对照组小鼠黑质多巴胺能神经元内的tau蛋白磷酸化水平很低,阳性率为17.58%(P0.01)。结论1.利用MPTP大剂量给药法建立了稳定的PD动物模型：MPTP可升高黑质多巴胺能神经元内磷酸化tau水平,诱导黑质神经元凋亡,使黑质内残存的功能神经元减少,纹状体内多巴胺含量降低,最终使小鼠肢体协调功能障碍,出现行为学异常；2.6-羟基-1-氢-吲唑降低黑质神经元内MPTP升高的tau的磷酸化水平、减少神经元的凋亡、增加黑质内残余神经元的数目、增加纹状体内多巴胺含量,并且改善PD小鼠的行为学变化；3.我们的实验结果为研究开发抗PD药物提供了一个新策略,那就是“抑制tau过度磷酸化”。
【关键词】：6-羟基-1-氢-吲唑 多巴胺能神经元 tau蛋白 MPTP 帕金森病
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965;R-332
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-30
• 1.1 材料与仪器30-34
• 1.2 实验方法34-42
• 1.3 实验结果42-51
• 1.4 实验讨论51-55
• 1.5 结论55-56
• 参考文献56-65
• 缩略词表65-66
• 攻读学位期间成果66-67
• 致谢67-69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张如意,张兰,叶翠飞,李林;MPTP对小鼠行为学及脑纹状体多巴胺含量的影响[J];中国行为医学科学;2001年03期

  本文关键词：6-羟基-1-氢-吲唑对MPTP帕金森病模型小鼠的保护作用，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：382159