间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制

发布时间：2017-05-21 16:08

  本文关键词：间充质干细胞体外培养方法改良及其诱导调节性树突状细胞的机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:间充质干细胞是一种具有自我复制和多向分化潜能的干细胞。其在临床上应用广泛,可用于治疗GVHD(Graft-versus-host disease)、促进造血重建等。此外,间充质干细胞还可以抑制异种抗原刺激所致的淋巴细胞反应、促进调节性T细胞生成等,具有广泛的免疫调节作用。并且,近期研究发现,其不但对特异性免疫应答具有重要的调节作用,对非特异性免疫应答细胞亦具有调节作用。研究发现,其可能参与“调节性树突状细胞”的形成,但是目前对其作用机制尚不明确。间充质干细胞已成为干细胞领域研究的重点,具有广阔的应用前景,但是目前常用的体外培养间充质干细胞的方法容易导致其干性降低、细胞凋亡以及衰老。因此,本课题拟寻找一种可以维持间充质干细胞干性,降低其凋亡、延缓衰老进程的培养方法;并对其与树突状细胞之间相互作用的机制进行初步探讨。方法:将壳聚糖溶解于醋酸后涂覆于培养板表面,在60℃烘箱中完全烘干,形成壳聚糖薄膜。后将分离出的小鼠骨髓间充质干细胞以同等密度接种于涂覆有壳聚糖的培养板和普通未经处理的培养板上,培养5天后收集两组细胞检测其干性相关标志分子CD44、Sca-1的表达情况;分别用PI-Annexin V和Hochest33342进行染色和标记,用流式细胞仪和荧光显微镜分析和观察细胞凋亡的情况;最后用β-Gal细胞衰老染色试剂盒进行染色,在光学显微镜下观察细胞的衰老情况。通过上述实验分析三维球体培养方式对间充质干细胞干性、凋亡和衰老的影响。为了研究间充质干细胞与树突状细胞之间相互作用的机制,我们收集生长状态良好的间充质干细胞培养上清,从中分离出外泌体并添加到树突状细胞的培养基中,通过ELISA的方法检测树突状细胞分泌的IL-10的情况。将与外泌体共培养48h后的树突状细胞与小鼠淋巴细胞共培养72h,之后用流式细胞仪分析淋巴细胞中CD4+CD25+细胞即调节性T细胞的比例以及分析T细胞增殖能力的变化。通过对树突状细胞分泌IL-10以及其激活T细胞能力的变化进行分析,探讨外泌体是否参与间充质干细胞对树突状细胞的调节。结果:间充质干细胞在壳聚糖薄膜上培养1天即开始出现聚集的趋势,到第3天即呈半悬浮的三维球体状态。通过各个实验结果发现:三维球体状态下生长的间充质干细胞其干性相关分子CD44和Sca-1的表达比例要明显高于对照组,很好的保持了其干性;流式细胞仪结果显示的凋亡细胞比例以及在荧光显微镜下观察的凋亡情况表明,三维球体的培养状态很好的延缓了细胞的凋亡;光学显微镜下观察β-Gal染色结果可以看出,对照组细胞明显比三维球体培养的细胞更早的出现了衰老。将生长状态良好的间充质干细胞分泌的外泌体与树突状细胞共培养48h,树突状细胞分泌IL-10的量高于对照组;加入外泌体后,树突状细胞对T细胞的激活作用减弱,反而诱导出更多的调节性T细胞;并且刺激T细胞增殖的能力也有所下降。结论:间充质干细胞近年来备受关注,目前在组织工程和细胞治疗领域均有广泛的应用。但在目前的培养条件下容易过早的丧失干性、凋亡和衰老,从而严重影响其应用价值。我们采用壳聚糖薄膜的方法,使间充质干细胞呈三维球体状态生长,模拟细胞在体内的生长方式,不仅很好的保持其干性,而且减缓了凋亡和衰老的进程,使间充质干细胞可以更好的应用于科研和临床。通过分析树突状细胞分泌IL-10以及激活T细胞的结果,可以看出外泌体与细胞因子和细胞接触一起参与了间充质干细胞对树突状细胞的调控,可能是通过其包含的蛋白或核酸发挥了作用。间充质干细胞免疫调控的机制十分复杂,还需要更进一步的研究。
【关键词】：间充质干细胞 三维球体培养 树突状细胞 外泌体 调节性树突状细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-16
• 研究现状、成果11-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、间充质干细胞体外培养方法的改良16-25
• 1.1 对象和方法16-18
• 1.1.1 实验材料16-17
• 1.1.2 实验方法17-18
• 1.2 结果18-21
• 1.2.1 包被壳聚糖培养板的制备及细胞接种18-19
• 1.2.2 三维培养对小鼠骨髓间充质干细胞干性的作用19-20
• 1.2.3 三维培养对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响20-21
• 1.2.4 三维培养对小鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响21
• 1.3 讨论21-23
• 1.4 小结23-25
• 二、间充质干细胞对树突状细胞免疫调节机制的研究25-43
• 2.1 材料和方法25-33
• 2.1.1 实验材料25-27
• 2.1.2 实验方法27-33
• 2.2 结果33-40
• 2.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养与鉴定33-35
• 2.2.2 小鼠骨髓树突状细胞的体外分离、培养与鉴定35-36
• 2.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞分泌的外泌体的分离与鉴定36
• 2.2.4 外泌体对树突状细胞免疫调控能力的影响36-40
• 2.3 讨论40-42
• 2.4 小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-52
• 发表论文和参加科研情况说明52-53
• 综述53-59
• 参考文献57-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张保琴;程万民;胡艳;;趋化因子与树突状细胞[J];解剖科学进展;2006年01期

2 邓春艳;李富荣;王新根;齐晖;文锦丽;周雅莹;;小鼠骨髓间充质干细胞对同种异体骨髓来源的树突状细胞分化和功能的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年12期

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本文编号：384138