重组人骨形态发生蛋白7成熟蛋白在悬浮CHO-S细胞中的稳定表达

发布时间：2023-06-01 23:08

　　目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7_m3;将mbmp7_m3克隆至表达载体pCHO1. 0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7_m3,转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验动物
    1.2 菌株、质粒及细胞株
    1.3 主要试剂
    1.4 引物设计及合成
    1.5 mbmp7的获取
    1.6 mbmp7基因的定点突变改造
    1.7重组表达质粒的构建
    1.8 rhBMP-7 CHO细胞株的获得
        1.8.1 稳定转染
        1.8.2 单克隆的筛选
        1.8.3 单克隆细胞的扩大培养
        1.8.4 单克隆产量的初步评估
2 结果
    2.1 mbmp7基因扩增产物的鉴定
    2.2 重组克隆质粒的鉴定
    2.3 重组表达质粒的鉴定
    2.4 rhBMP7的CHO细胞株单克隆初筛结果
    2.5 rhBMP7的CHO细胞株摇瓶筛选结果
3 讨论



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