人类TBC1D7蛋白的表达纯化及其在mTOR通路中的作用机制研究

发布时间：2023-07-01 12:38

　　mTOR信号通路在真核细胞代谢调控中发挥着关键的调控作用,该通路核心元件mTORC1复合物的活性受其上游TSC复合物负调控,TSC复合物包括TSC1、TSC2、TBC1D7三种蛋白.以TBC1D7蛋白为研究对象,通过氨基酸序列比对显示多物种来源的TBC1D7蛋白具有较高的保守性,且蛋白三维结构分析证实其分子表面存在高度保守区域.随后,构建了人类TBC1D7蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达得到全长TBC1D7蛋白,经过酶切去除标签和凝胶排阻层析得到了高纯度TBC1D7蛋白.另一方面,通过在HCM细胞中对TBC1D7进行敲降和过表达,证实了TBC1D7的表达会直接升高mTORC1的活性;反之,升高TBC1D7的表达则会抑制mTORC1的活性.本研究表达和纯化了人类TBC1D7蛋白,并探讨了在人类心肌细胞中TBC1D7的表达与其下游mTOR信号通路之间的联系,为人类TBC1D7蛋白和mTOR信号通路的进一步研究打下了良好基础.

【文章页数】：10 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 试剂与引物
    1.2 菌株、细胞和质粒
    1.3 序列保守性分析及进化树构建
    1.4 表达质粒的构建
    1.5 蛋白的原核表达
    1.6 Ni2+-NTA亲和层析
    1.7 凝血酶酶切去除组氨酸标签
    1.8 凝胶排阻层析
    1.9 细胞培养及转染
    1.10 定量PCR
    1.11 免疫沉淀及免疫印迹
    1.12 蛋白质三维结构分析
2 结果与分析
    2.1 氨基酸序列保守性分析
    2.2 人类TBC1D7蛋白分子表面残基保守性及电势能分析
    2.3 TBC1D7的克隆与表达
    2.4 TBC1D7蛋白的纯化
    2.5 TBC1D7的过表达和敲降
    2.6 TBC1D7表达水平的改变对mTORC1活性的影响
    2.7 TBC1D7与mTOR信号通路蛋白质作用网络分析
3 讨论



本文编号：3836265