埃博拉病毒生命周期相关重要宿主因子及抗病毒中和性抗体的研究

发布时间：2023-11-08 18:14

　　埃博拉病毒病(EVD)是由丝状病毒科埃博拉病毒(EBOV)感染人类和非灵长类动物导致的致命性传染性出血性疾病,病死率高。尽管目前针对EVD的研究和治疗取得显著进步,但EBOV在宿主细胞内的生命周期相关分子机制等仍不明确,可用于EVD患者的有效治疗仍非常有限。本研究拟在2级生物安全实验室环境下,构建具备复制和转录基本功能的埃博拉病毒样颗粒(EBOV-trVLPs),合成靶向与RNA病毒生命周期(病毒入侵、脱壳、融合、复制、装配及出芽等)密切相关的宿主siRNAs,通过RNA干扰(RNAi)来筛选对EBOV-trVLPs复制产生重要影响的宿主蛋白,并验证宿主蛋白与EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸的相互作用关系。通过杂交瘤技术合成抗EBOVGP和VP40单克隆抗体(mAb),开展体外抗EBOVGP和VP40 mAb单用及联合应用针对EBOV-trVLPs的抗病毒效应研究。在本研究中,我们发现宿主分子伴侣、膜转运蛋白和信号转导蛋白等与EBOV-trVLPs生命周期密切相关,并与trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸发生相互作用;证实抗GP和抗VP40 mAb的联合、抗VP40 ...

【文章页数】：160 页

【学位级别】：博士

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缩略词表
第一部分 埃博拉病毒样颗粒体外复制系统的建立
    1.1 背景
    1.2 材料和方法
        1.2.1 主要实验试剂和耗材
        1.2.2 细胞系和质粒
        1.2.3 质粒扩增、抽提与鉴定
        1.2.4 trVLPs的构建
        1.2.5 电镜观察trVLPs
        1.2.6 DiI标记的trVLPs入侵活细胞过程观察
        1.2.7 trVLPs的半数培养组织感染剂量(50% Tissue Culture Infective Dose,TCID50)测定
    1.3 实验结果
        1.3.1 EBOV-trVLPs模型能在体外细胞实验中稳定复制表达
        1.3.2 EBOV-trVLPs能在2级生物安全实验室从大小和形态学上模拟EBOV野毒株
        1.3.3 DiI-trVLPs入侵活细胞过程示踪
    1.4 讨论
    1.5 参考文献
第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相关重要宿主因子的筛选及相互作用的研究
    2.1 背景
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要实验试剂和耗材
        2.2.2 细胞系和质粒
        2.2.3 SiRNAs库的建立
        2.2.4 SiRNAs筛选流程
        2.2.5 RNAi与trVLPs感染
        2.2.6 RNA抽提及RT-PCR检测siRNAs敲减后细胞内trVLPs -RNA水平
        2.2.7 候选宿主蛋白抗体
        2.2.8 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)及蛋白免疫印迹实验
        2.2.9 染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)
        2.2.10 数据分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 候选宿主蛋白与trVLPs-GP相互作用
        2.3.2 候选宿主蛋白与trVLPs-VP40相互作用
        2.3.3 候选宿主蛋白与trVLPs核酸相互作用
    2.4 讨论
    2.5 参考文献
第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40单克隆抗体的抗病毒效应研究
    3.1 背景
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要实验试剂和耗材
        3.2.2 抗EBOV-GP和VP40单克隆抗体
        3.2.3 细胞和质粒
        3.2.4 trVLPs包装、检测
        3.2.5 RT-PCR验证GP及VP40-mAbs体外抗trVLPs效应
        3.2.6 蛋白免疫印迹验证GP及VP40-mAbs体外抗trVLPs效应
        3.2.7 细胞原位免疫荧光分析GP及VP40-mAbs抗trVLPs效应
        3.2.8 抗体可变域测序
        3.2.9 数据分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 抗GP和抗VP40抗体具备抗trVLPs效应
        3.3.2 抗GP和抗VP40抗体、抗VP40抗体之间的联合(抗体的鸡尾酒疗法)具有协同抗病毒效应
        3.3.3 抗体测序
    3.4 讨论
    3.5 参考文献
综述
    参考文献
附录
个人简历及攻读博士学位期间所取得的科研成果



本文编号：3861485