幽门螺杆菌cag致病岛hp0521基因功能研究

发布时间：2017-05-23 19:14

  本文关键词：幽门螺杆菌cag致病岛hp0521基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:hp0521基因是I型H.pylori携带的cag致病岛中2号基因,目前国内外对其研究仅仅停留于序列多样性及对Cag A转运和IL-8的影响。本实验针对H.pylori hp0521基因的多样性和功能,从生物信息学、分子生物学等方面研究其在H.pylori致病机制中的作用。方法:1.对H.pylori NCTC11637及临床菌株hp0521基因和cag A基因3,端可变区PCR扩增,测序。使用生物信息学软件分析hp0521基因基本理化性质、系统进化树构建等方面,同时探讨hp0521基因型与cag A可变区序列之间联系。2.依据HP菌株OM6004 hp0521基因,体外合成菌株26695补全两个碱基后CDS(coding sequence),构建表达载体p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521,Western Blot分析IPTG诱导表达的融合蛋白。3.分析H.pylori 26695和NCTC11637 hp0521基因序列抗原决定簇,合成具有强抗原性的多肽并免疫获得抗体,测效价。4.Western Blot验证HP菌株26695中hp0521基因编码的Cag2蛋白表达情况。5.构建p Blue KM40-(35)hp0521::kan自杀质粒,电击转化,抗性筛选,PCR及测序验证,获得缺失株△hp0521。6.测定相应时间点的OD值,比较野生株26695和缺失株△hp0521生长情况。7.提取野生株26695和缺失株△hp0521总RNA,逆转录,PCR法比较下游基因hp0522、hp0523极化情况。8.网站预测及文献查找hp0521互作基因,设计RT-PCR引物,比较其在m RNA水平上变化。9.Western Blot验证野生株26695和缺失株△hp0521中其他重要cag PAI编码蛋白的稳定性。10.进行HP与细胞共培养实验,探讨Cag A转运和IL-8分泌两者与hp0521基因缺失的关系。结果:1.获得HP菌株hp0521基因和cag A基因3,端可变区序列;hp0521基因编码理化性质稳定且无信号肽的Cag2蛋白,结构元件以无规则卷曲和α螺旋为主;Cag2蛋白与DNA拓扑异构酶I同源,有介导细胞壁延伸等蛋白标签;进化树分析分别获得其同源菌株。2.成功合成H.pylori 26695补全碱基后的CDS;成功构建原核表达载体p ET-32a-hpc0521和p ET-32a-hp0521;成功验证hpc0521基因转录翻译Cag2蛋白。3.成功制备效价是1:2.56×105的兔抗Cag2蛋白多克隆抗体。4.用制备的抗体,Western Blot证明H.pylori菌株26695 hp0521基因在菌体内不转录翻译为Cag2蛋白。5.成功构建自杀质粒p Blue KM40-(35)hp0521::kan;成功电转化获得缺失株:(35)hp0521。6.绘制野生株26695和缺失株△hp0521生长曲线,确定hp0521基因不影响菌株生长情况。7.确定hp0521基因缺失后不影响hp0522、hp0523基因转录。8.获得hp0521互作基因为hp0116、hp0333、hp0440、hp0515、hp0516、hp0520、hp0792、hp1293、hp1324、rpo B、cag A、vac A、ure A、fla B,经RT-PCR确定hp0521基因缺失后cag A、rpo B的m RNA水平上调。9.hp0521基因缺失后,cag PAI编码的Cag A蛋白表达量增加,Cag X、Cag M、Cag L、Cag S、Cag I、Cag V、Cagζ蛋白稳定性无影响。10.与GES-1共培养,缺失hp0521基因后Cag A转运和IL-8诱导无明显变化。结论:1.通过克隆、测序及分析了解HP菌株hp0521基因编码的Cag2蛋白具有DNA拓扑异构酶功能区,同时一般hp0521基因缺失的HP菌株cag A基因普遍携带EPIYA-D基序。2.H.pylori 26695 hp0521基因因缺失两个碱基后终止密码子提前导致其不编码Cag2蛋白。3.hp0521基因缺失对H.pylori的生长、对其他cag PAI编码蛋白的稳定性、对Cag A转运及IL-8诱导分泌无影响。4.hp0521基因可能与cag A、rpo B相互作用,且hp0521基因可能抑制Cag A蛋白的表达。
【关键词】：幽门螺杆菌 cag致病岛 hp0521 EPIYA-D CagA
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 绪论17-24
• 1.1 研究背景17-22
• 1.1.1 H.pylori简述17-18
• 1.1.2 H.pylori cag致病岛研究现状18-19
• 1.1.3 H.pylori CagA蛋白19-21
• 1.1.4 H.pylori hp0521基因21-22
• 1.2 本研究的目的、内容及技术路线22-24
• 1.2.1 研究目的22
• 1.2.2 研究内容22
• 1.2.3 技术路线22-24
• 第二章 H.pylori hp0521基因筛选及生物信息学分析24-45
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 临床患者的筛选和标本采集24
• 2.1.2 标准菌株和质粒24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 主要溶液的配制25-26
• 2.1.5 主要仪器设备26
• 2.1.6 主要网站及相关分析软件26-27
• 2.2 方法27-31
• 2.2.1 H.pylori的培养与鉴定27
• 2.2.2 H.pylori基因组DNA的抽提27
• 2.2.3 基因克隆引物的合成27-28
• 2.2.4 聚合酶链式（PCR）反应28
• 2.2.5 包含目的基因的PCR片段回收28-29
• 2.2.6 感受态细菌细胞的制备29
• 2.2.7 T-A连接实验29-30
• 2.2.8 连接产物的转化30
• 2.2.9 含目的基因大肠杆菌筛选鉴定30
• 2.2.10 目的基因序列测序分析30
• 2.2.11 生物信息学分析30-31
• 2.3 结果31-43
• 2.3.1 H.pylori分离、培养、鉴定31
• 2.3.2 基因PCR扩增31-32
• 2.3.3 基因序列测序、分析、确定32-33
• 2.3.4 hp0521基因编码Cag2蛋白的基本理化性质分析33-34
• 2.3.5 Cag2蛋白二级结构分析34-35
• 2.3.6 Cag2蛋白三级结构预测35-36
• 2.3.7 hp0521基因编码Cag2蛋白的信号肽预测36
• 2.3.8 Cag2蛋白跨膜区域预测36-38
• 2.3.9 Cag2蛋白功能结构域分析38-39
• 2.3.10 Cag2蛋白质指纹图谱分析39-41
• 2.3.11 hp0521基因系统进化树分析41-42
• 2.3.12 hp0521基因与cagA基因 3，端可变区相关性分析42-43
• 2.4 讨论43-45
• 第三章 H.pylori hp0521基因表达45-58
• 3.1 材料45-48
• 3.1.1 动物、菌株、质粒和软件45-46
• 3.1.2 主要试剂46
• 3.1.3 主要溶液配制46-48
• 3.1.4 主要仪器设备48
• 3.2 方法48-53
• 3.2.1 hp0521基因补全两个碱基（hpc0521）的合成48-49
• 3.2.2 重组原核表达质粒的构建和鉴定49-50
• 3.2.3 融合蛋白的诱导表达和全菌蛋白提取及Western Blot分析50-51
• 3.2.4 Cag2蛋白抗原表位分析51
• 3.2.5 Cag2多肽合成51
• 3.2.6 兔抗Cag2蛋白抗体的制备及效价测定51-52
• 3.2.7 标准H.pylori菌株全菌蛋白提取及Western Blot分析52-53
• 3.3 结果53-56
• 3.3.1 重组表达质粒pET-32a-hp0521和pET32a-hpc0521的构建53-54
• 3.3.2 重组表达质粒诱导表达后蛋白提取及Western Blot分析54-55
• 3.3.3 Cag2多肽序列选择及合成55
• 3.3.4 兔抗Cag2蛋白抗体效价测定55
• 3.3.5 抗Cag2蛋白抗体与H.pylori全菌蛋白Western Blot分析55-56
• 3.4 讨论56-58
• 第四章 H.pylori hp0521基因缺失株构建58-65
• 4.1 材料58-59
• 4.1.1 菌株、载体及软件58
• 4.1.2 主要试剂58
• 4.1.3 主要溶液配制58
• 4.1.4 主要仪器58-59
• 4.2 方法59-61
• 4.2.1 细菌的培养59
• 4.2.2 hp0521基因上、下游同源臂的扩增59
• 4.2.3 hp0521基因重组自杀质粒的构建和鉴定59-60
• 4.2.4 hp0521基因缺失株的构建和鉴定60-61
• 4.3 结果61-63
• 4.3.1 hp0521基因上、下游同源臂的PCR扩增61
• 4.3.2 hp0521基因缺失重组自杀质粒的鉴定61-62
• 4.3.3 hp0521基因缺失株的鉴定62-63
• 4.4 讨论63-65
• 第五章 hp0521基因功能初步探讨65-77
• 5.1 材料65-66
• 5.1.1 菌株、细胞65
• 5.1.2 主要试剂65
• 5.1.3 主要溶液配制65
• 5.1.4 主要仪器65-66
• 5.1.5 主要网站及软件66
• 5.2 方法66-70
• 5.2.1 H.pylori和细胞的培养66
• 5.2.2 H.pylori生长情况OD（光密度）值测定66
• 5.2.3 H.pylori总RNA的提取66-67
• 5.2.4 总RNA的逆转录67
• 5.2.5 H.pylori hp0521下游基因极化的影响67
• 5.2.6 与hp0521基因相互作用基因预测及RT-PCR引物设计67-69
• 5.2.7 hp0521基因与互作基因的荧光定量PCR69
• 5.2.8 H.pylori CagA蛋白表达量检测69
• 5.2.9 hp0521基因缺失对其他重要cagPAI编码蛋白稳定性的影响69-70
• 5.2.10 hp0521基因缺失对CagA转运的影响70
• 5.2.11 hp0521基因缺失对诱导细胞分泌IL-8 的影响70
• 5.3 结果70-75
• 5.3.1 H.pylori生长曲线的绘制70-71
• 5.3.2 H.pylori hp0521下游基因极化影响的PCR验证71-72
• 5.3.3 hp0521基因与互作基因的荧光定量PCR验证72
• 5.3.4 H.pylori CagA蛋白表达影响72-73
• 5.3.5 hp0521基因缺失对cagPAI编码的其他蛋白稳定性影响73
• 5.3.6 hp0521基因缺失对CagA蛋白转运的影响73-74
• 5.3.7 hp0521基因缺失对IL-8 诱导分泌的影响74-75
• 5.4 讨论75-77
• 第六章 主要结论及展望77-78
• 6.1 主要结论77
• 6.2 主要展望77-78
• 参考文献78-85
• 致谢85-86
• 攻读硕士学位期间发表的论文和参加的课题86

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