吡喹酮（PZQ）衍生物对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应及PZQ抗性虫体蛋白质组学分析

发布时间：2017-05-25 10:11

  本文关键词：吡喹酮（PZQ）衍生物对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应及PZQ抗性虫体蛋白质组学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:前期研究证明PZQ衍生物P96及DW-3-15具有显著的抗日本血吸虫成虫及童虫效应,本实验体外观察P96及DW-3-15对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应,探讨P96及DW-3-15作为抗日本血吸虫候选新药的潜在价值。方法:单性日本血吸虫尾蚴(70±5条)感染小鼠,21天后,用半数有效致死剂量(ED50,25.98 mg/kg)PZQ对小鼠进行灌胃给药,每天一次,连续30天,停药21天后,再给予小鼠治疗剂量(200 mg/kg)PZQ,连续5天。停药2周后肝门静脉灌注收集虫体,置DMEM培养液中培养,分别加入不同浓度PZQ、P96和DW-3-15,作用16 h(过夜)后换新鲜培养液,继续培养72 h,每24 h体视显微镜下观察、记录一次虫体活力和形态变化,评价诱导虫体对药物的敏感性。结果:PZQ、P96和DW-3-15体外抗未诱导日本血吸虫成虫的临界致死浓度(虫体经药物作用后72 h活力降低率达90%的最低浓度)分别为14μmol/L、25μmol/L和45μmol/L。诱导虫体对PZQ的敏感性显著降低,临界致死浓度是抗未诱导虫体的8倍(112μmol/L);而对P96的敏感性有一定的下降,临界致死浓度是抗未诱导虫体的4倍(100μmol/L);对DW-3-15的敏感性与未诱导虫体相比则没有明显差异,临界致死浓度仍为45μmol/L。结论:经PZQ持续压力诱导的日本血吸虫对PZQ具有明显抗性,与P96及DW-3-15相比存在显著性差异(P0.05),特别是对DW-3-15完全没有交叉抗性;提示PZQ衍生物P96及DW-3-15抗日本血吸虫的作用靶点与PZQ可能有一定差异,其作用机制可能不同,具有作为抗日本血吸虫候选新药的潜在价值,值得进一步研究。目的:通过观察Ahnak抗体拮抗PZQ体外抗日本血吸虫成虫生物学效应,探讨Ahnak蛋白是否是PZQ作用的重要靶分子。方法:肝门静脉灌注法收集感染小鼠体内的日本血吸虫成虫,进行体外培养,加入不同浓度(0.3、0.6、1.2、1.8、2.4μg/ml)Ahnak抗体,预孵育不同时间(0、1、2、4 h)后,再加入PZQ,作用16 h(过夜)后换液,继续培养72h,每隔24h置体视显微镜下观察、记录一次虫体存活数量和活力分值。结果:Ahnak抗体预孵育1 h,浓度为1.2μg/ml和1.8μg/ml时,对PZQ有明显拮抗作用,虫体72 h存活率均高达80%,活力降低率分别为71.1%和64.4%,与PZQ对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),其它浓度(0.3、0.6、2.4μg/ml)抗体对PZQ均无拮抗作用;抗体浓度为1.2μg/ml,预孵育时间为1 h,对PZQ有明显拮抗作用,其它预孵育时间(0、2、4 h),抗体对PZQ均无明显拮抗作用。结论:Ahnak抗体对PZQ的体外抗日本血吸虫成虫效应有一定的拮抗作用,Ahnak抗体预孵育1 h,浓度为1.2μg/ml是对PZQ的最佳拮抗方案,本研究结果为“钙通道—PZQ抗血吸虫效应靶点”假说提供了新的实验依据,Ahnak蛋白在日本血吸虫中的作用值得进一步研究。目的:利用蛋白质组学的方法和技术分离、鉴定PZQ抗性虫体与未诱导虫体之间的差异蛋白质,探讨PZQ抗血吸虫效应机制及潜在靶点。方法:应用PZQ抗日本血吸虫ED50和治疗剂量,使感染小鼠体内的虫体在持续药物压力下产生一定的抗药性,收集抗性虫体和未诱导虫体,提取总蛋白,采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术筛选、鉴定两种虫体的差异表达蛋白质。结果:经筛选、鉴定,PZQ抗性虫体共有40种差异表达蛋白质,其中有31种蛋白质表达上调,6种蛋白质表达下调,另有3种蛋白质变化趋势无法确定。表达上调的蛋白质中有3种为两种虫体共有,有28种只在PZQ抗性虫体蛋白质双向凝胶上筛选得到。这些蛋白分别归类于细胞结构及运动相关蛋白(9种)、应激反应相关蛋白(4种)、参与虫体代谢的酶类(7种)、蛋白质翻译和结构调节蛋白(5种)、离子调节蛋白(3种)和一些功能未知蛋白(12种)。结论:PZQ持续压力下可使日本血吸虫蛋白质水平发生明显改变,提示PZQ持续压力可能促进或抑制了虫体特定基因的表达,差异表达蛋白可能与药物作用靶点有关。目的:通过测定日本血吸虫PZQ抗性虫体与未诱导虫体m RNA相对表达量,分析两者在转录水平的差异,并结合蛋白质水平的差异进行综合分析,为探索PZQ抗虫机理、虫体抗药机制,研发新药和疫苗,建立实验基础。方法:收集PZQ抗性虫体和未诱导虫体,使用TRIzol法分别抽提两种虫体的总m RNA,逆转录得到c DNA。根据差异蛋白质登录号在NCBI上搜索对应基因序列,设计引物,采用实时荧光定量PCR技术对c DNA进行相对定量,进而分析两种虫体的转录水平差异。结果:PZQ抗性虫体中核糖体蛋白/大亚基和钙调节蛋白基因的m RNA相对表达量较未诱导虫体均下降,组蛋白H2A和热休克蛋白70基因的m RNA相对表达量升高,差异均具有显著性统计学意义(P0.01);而珠蛋白-3、磷酸丙糖异构酶、真核翻译延长因子1α2和肌球蛋白等基因的m RNA相对表达量与未诱导虫体无明显差异(P0.05)。所检测的8种基因中有7种在转录水平和蛋白质水平的差异变化存在不一致性,只有组蛋白H2A基因的转录水平和蛋白质水平的差异变化一致,均表达上调。结论:经PZQ压力诱导的日本血吸虫抗药性虫体可发生转录水平的改变,且在转录水平和蛋白质水平发生的变化不完全一致。
【关键词】：日本血吸虫 吡喹酮 抗药性 衍生物 Ahnak 蛋白质组学 转录水平
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 研究背景14-18
• 参考文献15-18
• 第一部分 PZQ衍生物P96 及DW315 对日本血吸虫PZQ抗性虫体的生物学效应观察18-29
• 材料与方法18-20
• 1 材料18
• 1.1 阳性钉螺与实验动物18
• 1.2 药物与试剂18
• 2 方法18-20
• 2.1 药物与试剂配制18-19
• 2.2 实验动物模型建立19
• 2.3 日本血吸虫体外培养19-20
• 2.4 体外培养日本血吸虫活力观察20
• 2.5 统计学处理20
• 结果20-25
• 1 PZQ、P96 和DW315 抗日本血吸虫成虫的生物学效应20-21
• 2 诱导虫体对PZQ、P96 和DW315 的敏感性观察21-22
• 3 未诱导虫体和PZQ抗性虫体的形态与活力观察22-25
• 3.1 未诱导和诱导虫体经PZQ、P96 和DW315 作用后即时形态学观察22-24
• 3.2 未诱导和诱导虫体经PZQ、P96 和DW315 作用 72h后的形态学观察24-25
• 讨 论25-27
• 参考文献27-29
• 第二部分 钙通道Β亚单位相关作用蛋白AHNAK在日本血吸虫中的初步研究29-38
• 材料与方法29-31
• 1 材料29-30
• 1.1 阳性钉螺与实验动物29
• 1.2 药物与试剂29-30
• 2 方法30-31
• 2.1 药物与试剂配制30
• 2.2 日本血吸虫感染小鼠模型的建立30
• 2.3 日本血吸虫成虫体外培养30
• 2.4 体外培养日本血吸虫活力观察30-31
• 2.5 统计学分析31
• 结果31-35
• 1 不同浓度AHNAK抗体拮抗PZQ体外抗日本血吸虫成虫效应31-32
• 2 不同预孵育时间AHNAK抗体拮抗PZQ体外抗日本血吸虫成虫效应32-35
• 讨论35-36
• 参考文献36-38
• 第三部分 日本血吸虫PZQ抗性虫体的蛋白质组学分析38-58
• 材料与方法38-48
• 1 材料38-43
• 1.1 阳性钉螺与实验动物38
• 1.2 药物与试剂38-39
• 1.3 主要试剂的配制39-43
• 1.4 主要仪器43
• 2 方法43-48
• 2.1 日本血吸虫PZQ抗性虫体的诱导及获得方法参见第一部分。43
• 2.2 虫体总蛋白的提取43
• 2.3 蛋白质定量43-44
• 2.4 蛋白质纯化44-45
• 2.5 双向凝胶电泳分析45-48
• 结果48-53
• 1 2D-PAGE分析48-50
• 2 LC-MS/MS分析50-53
• 讨论53-55
• 参考文献55-58
• 第四部分 日本血吸虫PZQ抗性虫体的转录水平分析58-67
• 材料与方法58-61
• 1 材料58-59
• 1.1 阳性钉螺与实验动物58
• 1.2 药物与试剂58
• 1.3 主要仪器58-59
• 2 方法59-61
• 2.1 日本血吸虫PZQ抗性虫体的诱导及获得方法参见第一部分。59
• 2.2 虫体总RNA的抽提及逆转录59-60
• 2.3 实时荧光定量PCR60-61
• 2.4 统计学处理61
• 结果61-63
• 1 PZQ抗性虫体与未诱导虫体MRNA相对定量分析61-62
• 2 PZQ抗性虫体与未诱导虫体的蛋白质水平和转录水平差异比较62-63
• 讨论63-65
• 参考文献65-67
• 全文小结67-68
• 综述：寄生虫药物抗性机制的研究进展68-80
• 参考文献76-80
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文80-81
• 附录一 缩写词表81-82
• 附录二 主要仪器与设备82-83
• 致谢83-84

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴亮;田德英;;晚期血吸虫病的中西医结合诊疗[J];临床肝胆病杂志;2015年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 康乃馨;白头翁皂苷单体抗日本血吸虫及曼氏血吸虫的活性和作用机制的研究[D];苏州大学;2015年

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本文编号：393413