小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶的结构分析及定点突变研究

发布时间：2017-05-25 08:03

  本文关键词：小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶的结构分析及定点突变研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica subsp.palearctica(Y.e.p))核酸酶是一种非特异性核酸酶,可以降解各种DNA和RNA,无论是单链、双链、线状、环状还是超螺旋形式,而且对核酸的序列没有要求。本实验室前期成功克隆了Y.e.p核酸酶的编码基因nuc,构建了重组表达载体pET24a-nuc,利用IPTG诱导获得重组核酸酶,研究了其酶学性质,发现重组核酸酶不仅具有酶活性高的优点,而且还具有超级耐高温、耐酸碱及耐化学物质等特点。为阐明该酶具有优良性能的原因,本论文通过生物信息学分析和定点突变的方法研究影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的因素,为进一步研究Y.e.p非特异性核酸酶的功能进化奠定基础。主要研究内容和结果如下:(1)用生物学软件全面分析Y.e.p非特异性核酸酶的一级结构、二级结构、结构域和三级结构,为Y.e.p非特异性核酸酶的定点突变研究提供理论基础。(2)通过对Y.e.p非特异性核酸酶活性位点、盐桥和二硫键定点突变的研究,改变活性位点氨基酸、破坏盐桥和二硫键组成,发现Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性急剧下降,说明活性位点对维持Y.e.p非特异性核酸酶的酶活,盐桥和二硫键对维持Y.e.p非特异性核酸酶的热稳定性具有重要作用。(3)序列比对热不稳定Y.e.e非特异性核酸酶和热稳定Y.e.p非特异性核酸酶,对差异氨基酸进行定点突变,结果发现E202A,I203F,D264E这三个位点氨基酸的改变能引起酶活及热稳定性变化,由此推测Glu202,Ile203和Asp264可能是影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的关键氨基酸残基。
【关键词】：小肠结肠炎耶尔森菌 非特异性核酸酶 定点突变 酶活 热稳定性
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R378
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 小肠结肠炎耶尔森菌简介12
• 1.2 非特异性核酸酶概述12-15
• 1.2.1 概念及发现12-13
• 1.2.2 催化作用方式13
• 1.2.3 热稳定性13-15
• 1.2.4 生物功能15
• 1.3 小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶研究15-16
• 1.4 酶分子的定点突变技术研究进展16-18
• 1.4.1 定点突变原理16-17
• 1.4.2 酶分子的结构分析和定点突变应用进展17-18
• 1.5 立题意义和主要研究内容18-20
• 1.5.1 立题意义18
• 1.5.2 主要研究内容18-19
• 1.5.3 技术路线19-20
• 第二章 Y.e.p非特异性核酸酶的生物信息学分析20-26
• 2.1 材料与方法20
• 2.2 结果与讨论20-25
• 2.2.1 Y.e.p非特异性核酸酶一级结构分析20-22
• 2.2.2 Y.e.p非特异性核酸酶二级结构分析和结构域分析22-24
• 2.2.3 Y.e.p非特异性核酸酶三级结构分析24-25
• 2.3 本章小结25-26
• 第三章 活性位点对Y.e.p非特异性核酸酶酶活的影响26-34
• 3.1 材料26-28
• 3.1.1 菌株与质粒26
• 3.1.2 工具酶和试剂盒26
• 3.1.3 主要试剂26-27
• 3.1.4 培养基和工作液27
• 3.1.5 主要仪器27-28
• 3.2 实验方法28-31
• 3.2.1 定点突变引物设计28
• 3.2.2 定点突变基因的获得28-29
• 3.2.3 突变酶的诱导表达29
• 3.2.4 突变酶蛋白含量测定29-30
• 3.2.5 酶活测定30-31
• 3.3 结果与讨论31-33
• 3.3.1 活性位点预测31
• 3.3.2 突变位点选择31
• 3.3.3 蛋白含量测定31
• 3.3.4 酶活测定和分析31-33
• 3.4 本章小结33-34
• 第四章 盐桥对Y.e.p非特异性核酸酶热稳定性的影响34-38
• 4.1 材料34
• 4.2 实验方法34-35
• 4.2.1 定点突变引物设计34
• 4.2.2 定点突变基因的获得34
• 4.2.3 突变酶的诱导表达34
• 4.2.4 突变酶蛋白含量测定34
• 4.2.5 热稳定性测定34-35
• 4.3 结果与讨论35-37
• 4.3.1 盐桥分析35
• 4.3.2 突变位点选择35
• 4.3.3 蛋白含量测定35-36
• 4.3.4 热稳定性测定和分析36-37
• 4.4 本章小结37-38
• 第五章 二硫键对Y.e.p非特异性核酸酶热稳定性的影响38-47
• 5.1 材料38
• 5.2 实验方法38-42
• 5.2.1 二硫键质谱分析38-39
• 5.2.1.1 质谱分析原理38
• 5.2.1.2 质谱实验方法38-39
• 5.2.1.3 质谱数据处理39
• 5.2.2 定点突变39-42
• 5.2.2.1 定点突变引物设计39-40
• 5.2.2.2 定点突变基因的获得40-42
• 5.2.2.3 突变酶的诱导表达42
• 5.2.2.4 突变酶蛋白含量测定42
• 5.2.2.5 热稳定性测定42
• 5.3 结果与讨论42-46
• 5.3.1 二硫键预测42-43
• 5.3.2 二硫键的质谱分析43-44
• 5.3.3 突变位点选择44-45
• 5.3.4 蛋白含量测定45
• 5.3.5 热稳定性测定和分析45-46
• 5.4 本章小结46-47
• 第六章 基于热不稳定和热稳定核酸酶序列比对的定点突变研究47-52
• 6.1 材料47
• 6.2 实验方法47-48
• 6.2.1 定点突变引物设计47-48
• 6.2.2 定点突变基因的获得48
• 6.2.3 突变酶的诱导表达48
• 6.2.4 突变酶蛋白含量测定48
• 6.2.5 酶活测定48
• 6.2.6 热稳定性测定48
• 6.3 结果与讨论48-51
• 6.3.1 突变位点选择48-49
• 6.3.2 蛋白含量测定49-50
• 6.3.3 酶活测定和分析50
• 6.3.4 热稳定性测定和分析50-51
• 6.4 本章小结51-52
• 结论与展望52-54
• 参考文献54-60
• 英文缩略词60-61
• 作者简介61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郑敏婧;李晓云;李玲;;野葛葡糖基转移酶PlUGTs的同源建模及其活性位点分析[J];生物信息学;2013年04期

  本文关键词：小肠结肠炎耶尔森菌非特异性核酸酶的结构分析及定点突变研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：393100