人星状病毒非结构蛋白C末端nsP1a/4蛋白6种删除突变体的构建与表达分析

发布时间：2024-04-13 02:49

　　星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是通过引起小肠上皮细胞凋亡从而导致婴幼儿腹泻的重要病原体。课题组前期研究表明HAstV非结构蛋白nsP1aC末端蛋白nsP1a/4是诱导凋亡的主要功能性蛋白,可能含有与凋亡相关的重要结构域。为了探索nsP1a/4蛋白中的凋亡结构域,本研究采用绿色荧光蛋白真核表达载体,根据nsP1a/4蛋白功能性结构域的位置,选择不同的删除位点,构建nsP1a/4蛋白及不同结构域删除的nsP1a/4蛋白突变体,并将其转染BHK21细胞,在转染的24～72h检测重组蛋白在细胞内的表达并进行初步分析。结果显示,24h后荧光显微镜下可观察到融合nsP1a/4蛋白和其突变体的绿色荧光。Western blot分析结果显示7种融合蛋白均能在体外细胞中高效表达,72h表达量明显高于48h。这些结果表明我们构建的nsP1a/4蛋白及其删除突变体可在BHK21细胞中表达,可用于HAstV非结构蛋白nsP1a/4的凋亡结构域研究,从而为进一步研究HAstV分子致病机制提供研究平台。

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【文章目录】：
材料与方法
    1 HAstV nsP1a/4蛋白不同删除突变位点的选择
    2 不同删除突变体真核表达载体构建
        2.1 引物设计
        2.2 目的片段扩增及双酶切反应
        2.3 重组体的连接、转化
        2.4 重组体鉴定
    3 重组删除突变体在体外BHK21细胞中的表达分析
        3.1 重组体突变体的转染
        3.2 重组蛋白在细胞内的瞬时表达检测
结果
    1 7种重组体的酶切鉴定
    2荧光显微镜下重组蛋白的表达
    3 Western blot检测细胞内重组蛋白表达
讨论



本文编号：3952362