重组cTnI-cTnC复合抗原的制备及其性能验证

发布时间：2024-05-06 22:39

　　目的采用E. coli表达系统分别表达心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和cTnC,制备cTnI-cTnC二元复合蛋白,并验证其抗原性能。方法将合成的cTnI和cTnC基因片段分别插入pET-22b和pET-28a原核表达载体,构建重组表达质粒,并分别转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。将表达的cTnI和cTnC蛋白经Ni²⁺螯合亲和层析和离子交换层析两步纯化后,在Ca²⁺存在的条件下按摩尔比1︰1混合,制备cTnI-cTnC二元复合蛋白。采用双抗夹心ELISA法检测复合蛋白的抗原反应性;将cTnI单体和cTnI-cTnC复合蛋白稀释后,均分别于4和37℃条件下放置14 d,检测cTnI抗原放置前后的浓度变化,验证其储存稳定性。结果纯化的cTnI和cTnC重组蛋白的SDSPAGE纯度均达90%以上。与对照抗原(8IC63二元复合抗原)比较,cTnI-cTnC复合蛋白与抗体反应信号较强,且能够同时被cTnI和cTnC抗体识别;经37℃热加速试验后,cTnI单体蛋白浓度降低约80%,而cTnI-...

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【部分图文】：

经琼脂糖凝胶电泳分析，cTnI-pET-22b质粒的菌落PCR和双酶切产物可见约600bp的特异片段，cTnC-pET-28a质粒的菌落PCR和双酶切产物可见498bp的特异片段，大小均与cTnI和cTnC基因片段理论值相符，见图1和图2。测得序列与原始模板基因序列比对完全....

与对照抗原比较，cTnI-cTnC复合蛋白与抗体反应信号较强，表明其具有良好的抗原反应性；且cTnI-cTnC复合蛋白能够同时被cTnI和cTnC抗体识别，表明cTnI-cTnC结合形成的复合物状态单一稳定。见表1。图3纯化产物的SDS-PAGE分析

图2重组表达质粒cTnC-pET-28a的PCR及双酶切鉴定（NcoⅠ/BamHⅠ）2.3.2储存稳定性

在4和37℃储存条件下放置14d,cTnI单体蛋白浓度较起始浓度均较大幅度降低，降幅达30%～80%之间，可能的原因是在储存过程中发生蛋白降解导致其浓度大幅降低，且37℃加速了其降解速率；而cTnI-cTnC复合蛋白的浓度变化较小，即使在37℃热加速条件下，浓度变化幅度均在±1....

本文编号：3966444