痢疾杆菌效应蛋白调节宿主蛋白质泛素化信号途径的结构生物学研究

发布时间：2017-05-28 13:08

  本文关键词：痢疾杆菌效应蛋白调节宿主蛋白质泛素化信号途径的结构生物学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：痢疾杆菌是细菌性痢疾的病原菌,它能够利用自身毒性质粒编码的三型分泌系统向宿主细胞内分泌效应蛋白。效应蛋白以宿主细胞内的关键信号分子为靶标,调节细胞内的信号通路,以利于痢疾杆菌在宿主细胞内增殖转移。蛋白质泛素化途径是细胞内极其重要的一个翻译后修饰途径,因此也常常被效应蛋白作为攻击目标。本文以痢疾杆菌效应蛋白OspI和IpaH3为研究对象,利用结构生物学的方法,解析效应蛋白调节宿主泛素化过程的分子机制。已有研究发现痢疾杆菌效应蛋白OspI能够使Ubc13的Gln100脱酰胺化,导致Ubc13失活,破坏了宿主细胞内的NF-kB信号通路。IpaH3作为一个泛素连接酶,能够特异地结合共价连接有泛素的UbcH5c,在下游底物上连接形成K48的泛素链。但是,OspI-Ubcl3与IpaH-UbcH5c间相互作用的分子机制仍是一个未解之谜。 本文通过原核表达系统高效表达了OspI及其宿主靶分子泛素结合酶Ubc13,并通过纯化获得二者的高纯度重组蛋白,二者经孵育后形成稳定的效应蛋白-宿主靶分子复合物。通过复合物结晶实验,我们获得了衍射分辨率为2.3埃的复合物晶体。通过结构分析,我们发现OspI通过两个不同的表面电荷区与Ubc13的α1-螺旋、L1loop和L2loop相互作用,也进一步揭示了OspI的脱酰胺酶催化机制。 另外,我们通过原核表达系统,高效表达和纯化获得了IpaH3的重组蛋白,并且成功地在体外合成了Ub共价连接的泛素结合酶UbcH5c (UbcH5c-Ub)。然后,我们利用分子筛证明了IpaH3与UbcH5c-Ub之间的相互作用。在经孵育后筛选,我们获得了许多的结晶条件,从众多条件中成功筛选到IpaH3-UbcH5c-Ub复合物晶体。接下来我们需要进一步解析IpaH3-UbcH5c-Ub复合物晶体结构,进而阐明二者之间的相互作用。
【关键词】：痢疾杆菌 效应蛋白 蛋白泛素化 结构生物学
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 目录10-13
• 第1章 绪论13-24
• 1.1 痢疾杆菌13-17
• 1.1.1 痢疾杆菌的发现及其致病性13-14
• 1.1.2 痢疾杆菌的感染过程14
• 1.1.3 痢疾杆菌的毒性质粒14-15
• 1.1.4 痢疾杆菌的三型分泌系统15-16
• 1.1.5 痢疾杆菌效应蛋白16-17
• 1.2 泛素化系统17-21
• 1.2.1 什么是蛋白泛素化途径17-18
• 1.2.2 蛋白泛素化途径的基本成分18-21
• 1.2.2.1 泛素(Ub)18-19
• 1.2.2.2 泛素激活酶(E1)19
• 1.2.2.3 泛素结合酶(E2)19-21
• 1.2.2.4 泛素连接酶(E3)21
• 1.3 痢疾杆菌效应蛋白对蛋白泛素化途径的调控21-24
• 1.3.1 痢疾杆菌效应蛋白OspI21-22
• 1.3.2 痢疾杆菌效应蛋白IpaH322-24
• 第2章 材料和方法24-43
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 实验材料24
• 2.1.2 实验试剂24-25
• 2.1.3 实验仪器25-26
• 2.2 方法26-43
• 2.2.1 常用试剂的配置26
• 2.2.2 分子克隆26-32
• 2.2.3 目的基因的鉴定32-34
• 2.2.4 蛋白的表达与纯化34-38
• 2.2.5 蛋白之间相互作用的检测38-39
• 2.2.6 E2～Ub的制备39
• 2.2.7 蛋白结晶39-41
• 2.2.8 数据的收集和处理41-43
• 第3章 结果和讨论43-70
• 3.1 效应蛋白OspI和Ubc13复合物的结构生物学研究43-54
• 3.1.1 OspI C62A突变体的表达纯化43-45
• 3.1.1.1 OspI C62A的亲和纯化结果43
• 3.1.1.2 OspI C62A的进一步纯化结果43-45
• 3.1.2 Ubc13的表达纯化45-47
• 3.1.2.1 Ubc13的亲和纯化结果45
• 3.1.2.2 Ubc13的进一步纯化结果45-47
• 3.1.3 OspI-Ubc13复合物晶体的筛选、优化与衍射47-50
• 3.1.3.1 OspI-Ubc13复合物晶体的初步筛选及晶体优化47-48
• 3.1.3.2 OspI-Ubc13复合物晶体的衍射结果48-50
• 3.1.4 OspI-Ubc13复合物的结构解析50-54
• 3.1.4.1 OspI-Ubc13复合物的整体结构50-51
• 3.1.4.2 OspI与Ubc13间的相互作用面51-52
• 3.1.4.3 OspI的催化机制52-53
• 3.1.4.4 OspI催化口袋的构象变化53-54
• 3.2 效应蛋白IpaH3和UbcH5c～Ub复合物的结构生物学研究54-70
• 3.2.1 IpaH3的表达纯化54-56
• 3.2.2 UbcH5C～Ub的合成与纯化56-61
• 3.2.3 IpaH3 CTD与UbcH5c～Ub间的相互作用检测61-63
• 3.2.4 IpaH3与UbcH5c～Ub的结晶与优化63-70
• 3.2.4.1 IpaH3 CTD与UbcH5c～Ub复合物晶体的初步筛选63-65
• 3.2.4.2 非复合物晶体的排除65-67
• 3.2.4.3 全长IpaH3与UbcH5c-Ub复合物晶体的筛选及优化67-70
• 结论70-72
• OspI与Ubc13的复合物的结构生物学研究70
• IpaH3与UbcH5c～Ub的复合物的结构生物学研究70-72
• 参考文献72-77
• 个人简历77

【共引文献】

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  本文关键词：痢疾杆菌效应蛋白调节宿主蛋白质泛素化信号途径的结构生物学研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：402701