Fancd2os基因在小鼠不同组织中的表达谱分析及其真核表达载体的构建与鉴定

发布时间：2017-05-30 18:10

  本文关键词：Fancd2os基因在小鼠不同组织中的表达谱分析及其真核表达载体的构建与鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:哺乳动物的精子发生是极其复杂而精细的过程,是睾丸组织各类细胞与细胞内外环境相互作用的结果,其中睾丸组织特异表达或者高表达基因可能起着关键性的作用。本研究在课题组前期工作基础上,通过生物信息学方法分析Fancd2os基因及其编码蛋白的基本性质;随后应用分子生物学基本技术从m RNA和蛋白质水平分析Fancd2os基因在小鼠不同的组织和不同发育阶段的睾丸组织中的表达,利用组织化学染色技术对Fancd2os蛋白进行细胞定位;并构建Fancd2os基因的真核表达载体初步探讨其可能的生物学作用,为深入研究Fancd2os基因的功能奠定基础。方法:1、利用生物信息学软件和相关数据库对Fancd2os基因及其编码蛋白质进行结构分析和功能预测,包括同源性、进化树、蛋白质理化性质、跨膜区、亲疏水性、信号肽、亚细胞定位、翻译后修饰位点、磷酸化位点、抗原表位位点、蛋白质二级结构、相互作用、电子表达谱以及GEO(Gene Expression Omnibus)数据库等分析和预测。2、应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Fancd2os m RNA在小鼠七种组织的表达情况。3、应用免疫印迹(Western blotting)技术分析Fancd2os蛋白在小鼠七种组织中的表达水平。4、利用实时定量PCR(real-time PCR)分析Fancd2os m RNA在不同发育阶段的睾丸组织中的表达。5、应用免疫印迹(Western blotting)技术分析Fancd2os蛋白在不同发育阶段的睾丸组织中的表达。6、通过免疫组织化学染色检测Fancd2os蛋白在小鼠睾丸组织中的细胞定位。7、利用分子克隆技术构建Fancd2os基因的真核表达载体p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os,并进行鉴定。8、将重组质粒通过脂质体介导转染HEK293T细胞,并分别采用反转录PCR和Western blotting检测Fancd2os基因的表达情况。结果:1、生物信息学分析提示Fancd2os基因位于小鼠6号染色体E3部分,c DNA全长为1358bp,开放阅读框包含536个核苷酸,编码产生含178个氨基酸的蛋白质产物,酸性氨基酸13个,碱性氨基酸23个,理论等电点为9.56,不稳定系数为51.95;小鼠Fancd2os蛋白的氨基酸序列与大鼠、牛、人的相似性分别为97.8%、93.3%、92.1%;蛋白质二级结构预测表明该蛋白质含有55.62%的无规则卷曲,30.34%的α螺旋;应用PSORT预测Fancd2os蛋白定位在细胞浆可能性最大,预测值为45%,该蛋白无信号肽序列和跨膜序列,为亲水性蛋白;磷酸化位点分析预测Fancd2os蛋白质存在8个色氨酸磷酸化位点和5个苏氨酸磷酸化位点,采用Motif Scan预测结果提示Fancd2os蛋白含有10个翻译后修饰位点,分别是1个c AMP磷酸化位点、3个CKⅡ磷酸化位点和6个PKC磷酸化位点;EST电子表达谱显示Fancd2os基因主要在睾丸组织中表达,肾脏组织微弱表达;GEO数据库分析结果提示Fancd2os基因的表达可能与线粒体Clp P蛋白酶的表达密切相关;MGI Interaction Explorer数据库检索发现Fancd2os基因与95个mi RNA具有相互作用。2、半定量RT-PCR分析表明Fancd2os基因在睾丸组织中的表达非常显著,肾脏组织表达微弱,其它他组织未检测到表达条带。3、Western blotting结果表明该蛋白主要表达于睾丸组织,肾脏也有微弱表达,其它组织未见明显阳性条带。4、实时定量PCR检测结果表明Fancd2os基因在不同周龄的小鼠睾丸组织中具有显著的阶段特异性表达特征,以8周龄小鼠表达水平最高。5、Western blotting结果显示Fancd2os蛋白在不同周龄的小鼠睾丸组织中具有明显的阶段特异性,以8周龄小鼠表达水平最高。6、免疫组织化学染色显示Fancd2os蛋白在睾丸曲细精管中定位主要集中在精母细胞和圆形精子细胞的胞质中。7、PCR、双酶切图谱和DNA测序结果均显示Fancd2os基因真核表达载p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建成功。8、反转录PCR和Western blotting结果表明p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os重组质粒转染HEK293T细胞后,Fancd2os基因可以表达其蛋白产物。结论:Fancd2os基因及其编码蛋白在小鼠多种组织中具有显著的差异表达,为睾丸组织高表达基因,并且其m RNA及蛋白的表达水平随着小鼠睾丸的发育过程呈上调趋势。结合生物信息学分析结果,推测Fancd2os基因可能与睾丸组织的发育及精子发生过程有关,利用本研究成功构建的Fancd2os基因真核表达载体可以进一步在细胞水平探讨该基因的功能,尤其是在精子发生中的具体作用。
【关键词】：Fancd2os 生物信息学 睾丸组织 精子发生
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-31
• 1.1 实验材料15-20
• 1.2 研究方法20-31
• 2 结果31-49
• 2.1 Fancd2os基因及编码蛋白的生物信息学分析31-40
• 2.2 Fancd2os基因的组织特异性表达40-41
• 2.3 Fancd2os基因在小鼠睾丸组织的阶段特异性表达41-43
• 2.4 Fancd2os蛋白在小鼠睾丸组织中的细胞定位43-45
• 2.5 Fancd2os基因重组质粒的构建与鉴定45-47
• 2.6 重组质粒在HEK293T细胞中的表达47-49
• 3 讨论49-53
• 4 结论53-54
• 参考文献54-57
• 综述57-72
• 参考文献67-72
• 致谢72-73
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果73-74
• 个人简历74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 景花;宋沁馨;周国华;;MicroRNA定量检测方法的研究进展[J];遗传;2010年01期

2 冉茂良;陈斌;尹杰;杨岸奇;蒋明;;睾丸发育和精子生成相关miRNA研究进展[J];遗传;2014年07期

  本文关键词：Fancd2os基因在小鼠不同组织中的表达谱分析及其真核表达载体的构建与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：407679