多种载体蛋白对TNFα免疫原性影响的初步研究

发布时间：2017-06-06 21:02

  本文关键词：多种载体蛋白对TNFα免疫原性影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是一种可以杀伤某些肿瘤细胞使肿瘤出血性坏死但不杀伤正常组织细胞的细胞因子。它可以介导多种免疫调节反应和炎症反应,是近年来抗癌药物研究的一个重要靶点。当肿瘤坏死因子过量表达时,它会引发如类风湿关节炎、恶液质、感染性疾病等诸多疾病。那么控制体内TNFα表达的量是治疗上述疾病的关键。目前已有五种TNF-α单克隆抗体上市并在临床上取得了一定的效果。但是,这些单克隆抗体需要反复长期使用,用药剂量大,增加了细菌、结核等的感染风险。同时,这些药物的昂贵药价也使该种类的药物不能广泛应用。据统计,临床上接受TNFα单克隆抗体药物治疗的患者平均每年的花费超过2万美元,这样昂贵的医药费令许多患者望而却步。而疫苗既可诱导机体自身产生抗体,使用剂量又小,不需长期反复使用,避免了感染的风险也克服了易引发超敏反应的缺陷,因此靶向TNF-α的疫苗有着广阔的前景。TNF-Kinoid疫苗是人的TNF和KLH经过戊二醛化学偶联,并用甲醛对TNF生物活性进行灭活的蛋白化学偶联疫苗。经过十年的研发,在小鼠体内可以产生很好的免疫反应,并且有良好效果的中和抗体产生。2014年临床II期结果并没有取得良好的效果,分析原因可能是因为放大的疫苗灭毒工艺改变了其分子空间构象,破坏了疫苗的抗原性,使其没有产生针对TNF的中和抗体。TNFα由于具有生物活性,所以直接用于疫苗,会对人体产生一定的毒副作用,所以本实验室前期经过点突变的筛选,筛选到TNFY119N(简写为h TNFαmut)使其活性大大降低,利用这个点突变蛋白再与不同的载体蛋白化学偶联,考察不同载体蛋白对h TNFαmut免疫原性的影响。本研究将TNF-α作为靶点,利用同源重组的方法将h TNFαmut分别融合在CTB的氨基端和羧基端,并通过大肠杆菌分泌表达系统获得了两个融合蛋白。利用戊二醛化学偶联的方法制备h TNFαmut与不同载体蛋白的偶联蛋白。将制备的重组蛋白和偶联蛋白免疫Balb/C小鼠,使用ELISA检测抗血清中抗体的产生及血清抗体效价。结果显示,所有蛋白均能产生抗体且抗体的效价均大于1×105。同时,载体蛋白CTB偶联h TNFαmut及CTB-h TNFαmut自身偶联的蛋白产生的抗体效价高于对照组,其他载体蛋白偶联h TNFαmut产生的抗体效价低于对照组,初步评估霍乱毒素B亚基(CTB)可做为一种较好的载体蛋白来增强h TNFαmut在体内的免疫原性。
【关键词】：肿瘤坏死因子α 载体蛋白 化学偶联
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 TNFα 的研究进展12-13
• 1.1.1 TNFα 的发现与命名12
• 1.1.2 TNFα 的基因与蛋白结构12-13
• 1.1.3 TNFα 与相关临床疾病13
• 1.2 TNFα 在类风湿关节炎中作用的研究进展13-18
• 1.2.1 类风湿关节炎13-14
• 1.2.2 TNFα 在RA中的作用原理14
• 1.2.3 TNFα 的疫苗的研究进展14-15
• 1.2.4 Kinoid免疫原与免疫原的制备15-16
• 1.2.5 Kinoid的抗原性和免疫原性16
• 1.2.6 Kinoid的药效学与药物代谢动力学16-17
• 1.2.7 Kinoid的安全控制17-18
• 1.3 载体蛋白的研究进展18-20
• 1.3.1 白喉毒素DT18-19
• 1.3.2 霍乱毒素B亚基CTB19
• 1.3.3 结核分枝杆菌蛋白19-20
• 1.4 课题研究思路及技术路线20-22
• 1.4.1 课题研究的目的及思路20-21
• 1.4.2 课题研究的技术路线21-22
• 第二章 重组质粒CTB-hTNFα~(mut)和hTNFα~(mut)-CTB的构建22-36
• 2.1 本章介绍22
• 2.2 实验材料与仪器22-25
• 2.2.1 实验试剂22
• 2.2.2 试剂配制22-24
• 2.2.3 实验仪器24-25
• 2.3 实验方法25-33
• 2.3.1 融合蛋白的设计方案25-26
• 2.3.2 引物设计与合成26
• 2.3.3 目的基因TNFα 的扩增26-28
• 2.3.4 pCTB2质粒的单酶切与pCTB2质粒的双酶切28-29
• 2.3.5 hTNFα~(mut)-CTB与CTB-hTNFα~(mut)的构建29-33
• 2.4 实验结果33-35
• 2.4.1 重组蛋白表达载体设计33
• 2.4.2 重组质粒TNF-hTNFα~(mut)与CTB-hTNFα~(mut)的构建33-35
• 2.5 本章小结35-36
• 第三章 融合蛋白及载体蛋白的纯化36-60
• 3.1 本章介绍36
• 3.2 实验材料36-41
• 3.2.1 实验材料36-37
• 3.2.2 溶液的配制37-41
• 3.2.3 实验仪器41
• 3.3 实验方法41-54
• 3.3.1 hTNFα~(mut)的纯化41-46
• 3.3.2 CTB的纯化46-49
• 3.3.3 融合蛋白的纯化49-50
• 3.3.4 DTT的纯化50-52
• 3.3.5 结核分枝杆菌Rv2991和Rv3607的蛋白纯化52-54
• 3.4 实验结果54-58
• 3.4.1 目的蛋白纯化54-58
• 3.4.2 目标蛋白定量58
• 3.5 本章小结58-60
• 第四章 hTNFα~(mut)与不同载体蛋白化学偶联60-70
• 4.1 本章介绍60
• 4.2 实验材料60-63
• 4.2.1 药品与试剂60
• 4.2.2 试剂配制60-62
• 4.2.3 实验仪器62-63
• 4.3 实验步骤与方法63-64
• 4.3.1 戊二醛法化学偶联原理63
• 4.3.2 hTNFα~(mut)与Rv2991进行二步化学偶联法63-64
• 4.3.3 hTNFα~(mut)与不同载体蛋白进行一步化学交联法64
• 4.4 实验结果64-68
• 4.4.1 hTNFα~(mut)与Rv2991的二步化学偶联64-65
• 4.4.2 hTNFα~(mut)与不同载体蛋白的一步化学交联65-68
• 4.5 本章小结68-70
• 第五章 动物免疫及效价测定70-79
• 5.1 本章介绍70
• 5.2 实验材料与仪器70-72
• 5.2.1 实验试剂70-71
• 5.2.2 试剂配制71-72
• 5.2.3 主要的实验仪器72
• 5.3 实验方法72-75
• 5.3.1 小鼠免疫72-73
• 5.3.2 动物的采血及样品的处理73
• 5.3.3 ELISA法检测抗体的产生73-74
• 5.3.4 ELISA法测定血清的效价74-75
• 5.4 实验结果75-77
• 5.4.1 ELISA检测抗体产生75-76
• 5.4.2 ELISA检测抗体效价76-77
• 5.5 本章小结77-79
• 全文总结79-81
• 研究展望81-82
• 参考文献82-87
• 在校期间科研成果87-88
• 致谢88

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