炭疽杆菌荚膜表面寡糖抗原的合成研究

发布时间：2017-06-13 08:09

  本文关键词：炭疽杆菌荚膜表面寡糖抗原的合成研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：炭疽是由炭疽杆菌引起的致死性人畜共患传染病。据世界卫生组织(WHO)统计,全年平均炭疽发病人数为20000-100000例。同时,炭疽孢子由于具有重量轻、少量吸入即可致命的特点,可以制成生物武器,用于战争以及生物恐怖袭击。炭疽感染早期治疗首选抗生素,但对于中后期的炭疽毒血症治疗价值极其有限。而且,抗生素的广泛使用所致的耐药菌株不断出现也给治疗带来了前所未有的挑战。因此,做好炭疽感染的预防措施非常重要。而在各种预防手段中,免疫接种是防控人类传染病最有效且经济的方法。传统的炭疽疫苗主要有减毒活炭疽杆菌疫苗,AVA(Anthrax Vaccine Absorbed)以及AVP(Anthrax Vaccine Precipitated)疫苗。这些疫苗都存在成分不明确、产量不稳定,免疫效果差、剂量难以掌控和不良反应发生率高等缺陷。因此,研发新型炭疽疫苗具有很大的临床意义及市场需求。炭疽感染依赖于炭疽杆菌的两大毒力因子:炭疽毒素以及荚膜。在炭疽感染的发生与发展过程中,炭疽荚膜都发挥着决定性作用,如屏障作用,粘附作用,耐药作用,抵抗极端环境威胁等。因此,炭疽荚膜表面的多种特异性结构便成为了炭疽诊断与疫苗研发的热点靶标。近年炭疽荚膜表面一个特异性寡糖分子结构的阐明,又为发展炭疽疫苗提供了新的靶标抗原和分子基础。然而,单纯寡糖疫苗免疫原性较差,T-细胞非依赖性的抗体免疫反应发生率高。将糖抗原和载体蛋白结合,不仅可以提高糖类抗原的免疫原性还能够将它们转化成T-细胞依赖性的免疫抗原。近年来,具有免疫原性的糖蛋白缀合物已逐渐成为新型疫苗的研发热点,目前已有数十种糖蛋白疫苗用于临床。本课题以常见的葡萄糖,半乳糖和氨基葡萄糖盐酸盐为起始原料,采用乙酰基、苄基和对甲苯氧基等保护策略得到:单糖供体3、11和17及单糖受体5和7。经过连续的硫苷糖基化得到了四个炭疽寡糖化合物片段,包括:氨乙基-β-D-吡喃半乳糖基-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(23),氨乙基-β-D-吡喃半乳糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(28),氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(31),氨乙基β-D-吡喃葡萄糖基-(β1→4)-(β-D-吡喃半乳糖基)(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷(34)。而后,采用戊二醛法将上述寡糖片段偶联至血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)上,得到了8个糖蛋白缀合物:TM-1,TM-2,TM-3,TM-4 TM-5,TM-6,TM-7,TM-8。目标化合物及关键中间体的结构均通过1H-NMR,13C-NMR,ESI-MS和HR-QTOF-MS,MALDI-TOF确证。对KLH偶联物的初步免疫学研究显示,三糖缀合物TM-4,TM-6能够在小鼠体内引发抗原特异性的免疫反应,其中TM-4诱导产生的抗体滴度较高。本研究验证了低聚糖对疫苗开发和其它免疫学研究的潜力。
【关键词】：炭疽杆菌 糖蛋白 化学合成 糖基化
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-12
• 第一章 前言12-18
• 一、炭疽杆菌感染现状12-14
• 二、历史上的炭疽战与现代生物恐怖袭击14-15
• 三、炭疽致病机制15
• 四、炭疽临床表现15-16
• 五、炭疽的治疗与预防16-17
• 六、多糖疫苗的研究进展17-18
• 第二章 课题设计及逆合成分析18-26
• 一、设计思想18-20
• 二、逆合成分析20-21
• 三、合成路线21-26
• 第三章 实验部分26-43
• 第一部分 化学实验部分26-41
• 一、仪器设备与试剂耗材26
• 二、化学合成方法26-41
• 第二部分 免疫学实验部分41-43
• 一、仪器设备与试剂耗材41
• 二、酶联免疫吸附测定法（ELISA）41-43
• 第四章 实验结果与讨论43-50
• 一、中间体21的制备43
• 二、化合物27的制备43
• 三、化合物23的制备43-44
• 四、二糖受体的选择44-45
• 五、保护基的选择45-46
• 六、正交法探索α-硫苷糖基化最佳的反应条件46-48
• 七、ELISA检测结果48-50
• 第五章 小结50-51
• 参考文献51-56
• 综述 O-型糖苷化反应研究新进展56-70
• 参考文献64-70
• 在读期间发表论文与科研工作情况说明70-71
• 致谢71-72
• 附录72-93

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