效应蛋白OspF参与志贺氏菌对氟喹诺酮类药物敏感的研究

发布时间：2017-06-14 20:14

  本文关键词：效应蛋白OspF参与志贺氏菌对氟喹诺酮类药物敏感的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细菌性痢疾是由志贺氏菌(shigella spp.)引起的全球性感染性疾病。据世界卫生组织报告,全球约有1亿人患有由志贺氏菌引起的疾病,死亡人数超过100万。其中约95%以上的病例都发生在发展中国家,在我国每年也有约2千万人感染细菌性痢疾。而且在临床上,科学家们发现了许多多重耐药的志贺菌株。随着耐药菌株的出现和扩散,给细菌性痢疾的有效治疗带来了困难。临床上治疗细菌性痢疾常用的抗生素有β内酰胺类的氨苄西林、磺胺甲基异恶唑或氟喹诺酮类药物环丙沙星和相对补液等。氟喹诺酮类药物是目前治疗细菌性痢疾的首要选择。但是它们作用于志贺氏菌的具体机制尚未研究清晰。药物与靶标相互作用的经典途径主要有3种,第一种是抑制DNA的复制和修复,第二种是蛋白质合成的抑制,第三种是抑制细胞壁的合成。研究人员最近发现了一种新的机制,抗生素可以通过增加活性氧(ROS)的浓度,从而杀死细菌。ROS的产生与三羧酸循环,NADH的瞬态损耗,不稳定的铁-硫簇,以及芬顿反应的产生相关。志贺氏菌对抗生素的耐受主要通过以下两种机制,一种机制是抗生素靶基因的突变,另一种机制与外排泵系统的激活相关。志贺氏菌在感染宿主细胞时,其三型分泌系统会被激活,将效应蛋白分泌到宿主细胞内,引起细胞的炎症反应。氟喹诺酮类药物能以细菌内的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV为靶标,干扰细菌DNA的复制从而达到杀菌的效果。氟喹诺酮类药物还可以通过使细菌染色体片段化,在细菌体内形成药-酶-DNA稳定裂解复合物等方式来杀菌。目前也有许多关于志贺氏菌对喹诺酮药物耐受机制的研究。细菌主要是通过以下几个方式来降低药物的杀伤力。第一种机制是细菌将编码DNA促旋酶和拓扑异构酶IV的基因突变,这些突变在不改变酶活性的同时增加细菌对喹诺酮药物的耐受。这是细菌对喹诺酮药物耐受的主要机制。第二种机制是细菌内出现了一些耐药性质粒,这些质粒能够编码一些能够降低药物与DNA促旋酶和拓扑异构酶IV结合能力的蛋白,有些还可以编码与细菌外排泵相关的蛋白,使细菌主动将药物转运到体外。这种耐药机制是可以随着遗传物质的复制时遗传给下一代的。第三种是细菌染色体调节的对喹诺酮类药物耐受的机制。近年来发现的细菌染色体上的一些基因可以调节细菌细胞膜蛋白通道上的孔蛋白,从而增加菌对药物的耐受性。首先,我们测定了氟喹诺酮类药物氧氟沙星对Shigella flexneri 2a 301野生株,突变株△Osp F,以及回补株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),发现突变株△Osp F相比其余两个菌株对氧氟沙星药物出现了明显的耐受现象。随后我们又检测了莫西沙星,环丙沙星,诺氟沙星,萘啶酸这些氟喹诺酮药物对这三株菌的MIC,发现了类似的情况,因此我们想要探究志贺氏菌△Osp F突变株对氟喹诺酮类药物的耐受是怎样进行调控的。在初步发现突变株△Osp F对氟喹诺酮药物耐受这一现象后,我们随后采用不同浓度梯度的氟喹诺酮类药物处理这三株菌株,记录菌株在药物处理一定时间后的菌落形成单位(colony-forming unit,CFU),并计算存活率制作杀菌曲线,验证突变株△Osp F对氟喹诺酮药物的耐受表型。最后以过氧化氧(hydrogen peroxide,H202)处理以及厌氧环境培养菌株,来研究过氧化氢对志贺氏菌野生株和突变株的胁迫反应。实验结果表明:志贺氏菌突变株△Osp F在经过莫西沙星,环丙沙星,诺氟沙星,环丙沙星,氧氟沙星,萘啶酸处理后,表现出对这些药物的耐受表型。我们通过Western-blot以及PCR,证明了突变株以及回补株的成功构建。并且Western-blot验证了Osp F蛋白重组表达成功的回补株与野生型菌株一样对这些药物表现出了敏感表型。在双氧水耐受水平上,突变株△Osp F在较高浓度的双氧水处理下比野生型菌株表现出了一定程度的耐受现象。并且在加了一定浓度的硫脲和2,2联吡啶试剂后,能消除掉一定浓度的环丙沙星对野生型和突变株△Osp F引起的杀菌作用。我们在厌氧条件下,测定环丙沙星以及莫西沙星对野生型以及突变株的杀菌作用时,存活率比有氧条件下的存活要高。说明,活性氧的聚集能够增加这些抗生素对志贺氏菌的杀菌效果,△Osp F突变株,能够通过活性氧途径,增加其菌株在相关致死因子胁迫下的存活率。因此,本研究证明了志贺氏菌效应蛋白Osp F能够通过氧化压力这条途径来调控志贺氏菌对氟喹诺酮类药物的敏感现象。
【关键词】：志贺氏菌 氟喹诺酮类药物 抗生素耐受 OspF 效应蛋白
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第1章 综述13-25
• 1.1 志贺氏菌的简介13-19
• 1.1.1 志贺氏菌的分类及其基本特征13
• 1.1.2 志贺氏菌的致病机理13-16
• 1.1.3 三型分泌系统16-18
• 1.1.4 宿主的天然免疫系统对细菌入侵的应激反应18-19
• 1.2 氟喹诺酮类药物发展历程及作用机制19-22
• 1.2.1 氟喹诺酮类药物的发展历程19
• 1.2.2 氟喹诺酮类药物的主要靶点19-20
• 1.2.3 断裂复合体的形成与喹诺酮类药物的杀菌效果20-21
• 1.2.4 染色体片段化对细菌的杀菌效果21
• 1.2.5 活性氧与杀菌效果间的关联21-22
• 1.3 耐药机制22-23
• 1.3.1 靶标介导的喹诺酮耐药22
• 1.3.2 质粒调节的喹诺酮耐药22-23
• 1.3.3 染色体调节的喹诺酮耐药23
• 1.4 志贺氏菌效应蛋白OspF23-25
• 第2章 前言25-27
• 2.1 研究目的及意义25
• 2.2 研究内容与技术路线25-27
• 第3章 材料与方法27-41
• 3.1 实验材料27-31
• 3.1.1 菌株和质粒27
• 3.1.2 实验主要试剂27-28
• 3.1.3 实验仪器28-29
• 3.1.4 主要培养基和溶液的配制29-31
• 3.2 实验方法31-41
• 3.2.1 志贺氏菌OspF基因PCR引物设计与合成31
• 3.2.2 OspF基因的鉴定31
• 3.2.3 PCR产物凝胶回收31-32
• 3.2.4 OspF基因连接到Pet21a载体上，并转化到Top10感受态中。32-33
• 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化33-34
• 3.2.6 质粒提取步骤34-35
• 3.2.7 Pet21a OspF重组菌菌液制备35
• 3.2.8 OspF蛋白的纯化35-36
• 3.2.9 Shigella flexneri 2a 301野生株，突变株以及回补株中OspF蛋白的鉴定36-37
• 3.2.10 OspF抗体的制备37
• 3.2.11 OspF抗体的纯化37-38
• 3.2.12 抗体效价的检验38
• 3.2.13 MIC测定38-39
• 3.2.14 检测Shigella flexneri 2a 301野生株，突变株以及回补株中对氟诺酮类药物的敏感性39
• 3.2.15 在一定浓度氟喹诺酮类药物的处理下，Shigella flexneri 2a 301野生株，，突变株以及回补株存活率的测定39
• 3.2.16 双氧水耐受测试39-40
• 3.2.17 硫脲，2,2 联吡啶对药物杀菌作用的影响40
• 3.2.18 厌氧环境对药物杀菌作用的影响40
• 3.2.19 细菌体内活性氧的检测40-41
• 第4章 结果与分析41-57
• 4.1 OspF基因的PCR扩增鉴定41-42
• 4.2 OspF蛋白的纯化，以及抗体的制备与纯化42-43
• 4.3 Western-blot检测OspF基因在Shigella flexneri 2a 301野生株、△OspF突变株以及回补株中的表达43-44
• 4.4 生长速率的测定44-45
• 4.5 最小抑菌浓度的测定45-46
• 4.6 验证突变株的耐受表型46
• 4.7 在单一药物处理下存活率的测定46-50
• 4.8 志贺氏菌对双氧水耐受测试50
• 4.9 2,2 联吡啶与硫脲对抗生素杀菌作用的影响50-51
• 4.10 厌氧条件对抗生素杀菌效果的影响51-55
• 4.11 环丙沙星处理下，志贺氏菌内活性氧的变化55-57
• 第5章 讨论与展望57-60
• 5.1 实验结论57
• 5.2 讨论57-58
• 5.3 展望58-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-72
• 在校期间发表论文72

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