利用单细胞PCR从免疫后中国猕猴筛选H7N9高亲和力中和抗体

发布时间：2017-06-15 18:00

  本文关键词：利用单细胞PCR从免疫后中国猕猴筛选H7N9高亲和力中和抗体，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流感病毒目前是威胁人类健康的重大因素。近年来发生的禽流感H7N9、H5N6和H10N8感染人事件导致发病严重、死亡率高,对人类健康、经济发展和社会稳定等带来严重影响。目前主要应对流感病毒的措施是疫苗和抗病毒药物治疗。疫苗是预防流感病毒感染最有效的方式之一,但对目前突发的新亚型流感毒株缺乏保护作用;抗病毒药物在新病毒产生耐药株之前有治疗作用,感染后期治疗效果不明显。目前的抗流感药物包括M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶(NA)抑制剂,例如金刚烷胺和奥司他韦,虽然能有效抑制病毒复制,但容易出现耐药株。流感感染康复者的血清可以产生高滴度的抗体,能够有效地救治流感临床重症者,然而康复者有限,很难获得大量血浆,这难以应对流感大范围的爆发,并且还受到康复者血清抗体效价不均一等因素影响。本课题首先利用中国猕猴与人在遗传上具有高度同源的特点,用流感病毒疫苗免疫恒河猴,刺激B细胞产生中和抗体,并通过多次免疫的方法提高中和抗体的亲和力。然后,从免疫恒河猴外周血分离B细胞,猕猴的浆母细胞表型与人不同,用流式细胞分选仪,获得CD3-/CD19-/CD27-/CD80+标记的B细胞,利用单细胞PCR技术,在单细胞孔中克隆抗体重链和轻链的可变区基因,并在293T细胞中进行体外表达,得到重链和轻链可变区配对的抗体。该方法主要应用于浆母细胞和记忆性B细胞的克隆,相比于传统的抗体制备方法具有效率高、全人源、基因多样性更丰富等优势并体外表达抗体。最后,应用ELISA法检测抗原抗体亲和力、生物膜层干涉技术对亲和力进行定量分析、病毒微量中和实验检测抗体中和水平等方法,对抗体进行体外特性分析。利用上述实验方法,本实验筛选出一株高亲和力中和抗体2G11。利用ELISA实验检测抗体2G11与H7N9-Anhui蛋白的亲和力,结果显示:2G11可以结合H7N9-Anhui株,并且相比文献报道的流感广谱中和抗体FI6,2G11个结合活性是FI6的1000倍以上。同时Western Blot结果也显示2G11可以与H7N9-Anhui株蛋白很好地结合。利用病毒微量中和实验检测抗体中和病毒的能力,实验结果证明2G11抗体能显著中和H7N9流感病毒,实验数据显示,77μg/ml的抗体上清,按1:320稀释后依然可以中和90%的病毒,中和活性远远高于报道的FI6抗体。除此之外,生物膜核磁共振实验结果也同步显示2G11具有很强的亲和力,亲和力达到0.6 n M。血凝抑制实验证明2G11具有很高的中和滴度。本研究通过单细胞PCR技术从免疫的猕猴体内成功筛选到一株针对H7N9流感病毒的高亲和力中和抗体,为指导疫苗研制和临床救治提供了新的思路。
【关键词】：流感病毒 H7N9 中国猕猴 高亲和力 中和抗体 单细胞PCR
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• abstract5-7
• 英文缩写词7-12
• 1 前言12-26
• 1.1 H7N9的简介和研究现状12-17
• 1.1.1 H7N9的简介12-15
• 1.1.2 流感大流行和不断出现的流感感染人事件15-16
• 1.1.3 流感病毒预防与治疗的研究进展16-17
• 1.2 抗体结构和功能简介17-22
• 1.2.1 抗体的结构17-18
• 1.2.2 抗体功能介绍18
• 1.2.3 抗体基因的多样性18-20
• 1.2.3.1 抗体多样性的遗传学说18-19
• 1.2.3.2 V（D）J重组19
• 1.2.3.3 高频突变与亲和力成熟19-20
• 1.2.4 抗体的种类20-22
• 1.2.4.1 多克隆抗体20
• 1.2.4.2 单克隆抗体20-22
• 1.3 抗体筛选的技术22-26
• 1.3.1 噬菌体展示技术的简介22-23
• 1.3.2 酵母展示技术筛选抗体23
• 1.3.3 B细胞永生化23-24
• 1.3.4 单细胞PCR技术24-26
• 2 材料与方法26-48
• 2.1 实验材料26-28
• 2.1.1 分子克隆相关材料26
• 2.1.2 细胞培养和质粒转染相关试剂26
• 2.1.3 流感病毒26
• 2.1.4 SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色26
• 2.1.5 ELISA26-27
• 2.1.6 病毒微量中和实验27
• 2.1.7 血凝抑制实验（HI）27
• 2.1.8 Western blot实验材料27
• 2.1.9 BCA蛋白定量实验27
• 2.1.10 涉及的分析网站和分析软件27-28
• 2.2 实验仪器28-29
• 2.3 实验方法29-48
• 2.3.1 猕猴免疫30
• 2.3.2 猕猴PBMC分离30
• 2.3.3 猕猴PBMC抗体染色和流式分选30-31
• 2.3.4 单细胞PCR扩增31-33
• 2.3.5 一步法无缝克隆抗体基因33-39
• 2.3.5.1 抗体基因p CI-neo-Ig G1, p CI-neo-K/L线性载体制备35
• 2.3.5.2 线性化载体去甲基化35
• 2.3.5.3 线性化载体纯化35-36
• 2.3.5.4 抗体基因连接到对应载体上36
• 2.3.5.5 连接产物转化36-37
• 2.3.5.6 挑取单克隆细菌和菌液PCR鉴定37-38
• 2.3.5.7 阳性克隆送测序38
• 2.3.5.8 测序结果分析38
• 2.3.5.9 测序正确的菌液扩大培养并提取质粒38-39
• 2.3.6 抗体基因在 293T细胞中的表达39-40
• 2.3.7 SDS-PAGE及考马斯亮蓝检测抗体表达40-41
• 2.3.7.1 SDS-PAGE蛋白电泳40
• 2.3.7.2 SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色40-41
• 2.3.8 抗体凝缩和纯化41-42
• 2.3.8.1 细胞抗体上清离心超滤浓缩41
• 2.3.8.2 浓缩后抗体纯化实验41-42
• 2.3.8.3 SDS-PAGE胶鉴定纯化产物42
• 2.3.8.4 BCA法测定纯化产物浓度42
• 2.3.9 抗体与H7N9的HA蛋白结合能力检测42-43
• 2.3.10 生物膜层干涉技术（BLI）检测抗原抗体亲和力43-44
• 2.3.11 Western Blot方法检测抗体结合HA蛋白表位44-45
• 2.3.12 荧光病毒微量中和实验检测抗体中和滴度45-46
• 2.3.13 血凝抑制实验46-48
• 2.3.13.1 8单位抗原制备46
• 2.3.13.2 HI实验46-48
• 3 结果与分析48-61
• 3.1 猕猴免疫灭活H7N9流感疫苗的抗体反应48-49
• 3.2 流式分选单个猕猴浆母细胞49
• 3.3 单细胞PCR获得H7N9抗体基因49-50
• 3.4 H7N9抗体基因克隆和表达载体构建50-52
• 3.4.1 H7N9抗体基因扩增50-51
• 3.4.2 抗体基因与载体连接后鉴定51-52
• 3.4.3 2G11基因的序列分析52
• 3.5 H7N9抗体表达、鉴定和纯化52-54
• 3.5.1 SDS-PAGE检测抗体的表达52-53
• 3.5.2 2G11抗体纯化53-54
• 3.6 H7N9抗体活性分析54-58
• 3.6.1 ELISA检测 2G11与H7N9-HA结合能力54-56
• 3.6.2 Western blot分析抗原抗体结合表位56-57
• 3.6.3 生物膜层干涉技术检测抗原抗体亲和力57-58
• 3.7 病毒微量中和实验检测抗体中和活性58-59
• 3.8 HI血凝抑制检测抗体中和滴度59-61
• 4 讨论与结论61-63
• 4.1 讨论61-62
• 4.1.1 分离浆母细胞筛选抗体是有效分离高亲和力抗体的方法61
• 4.1.2 猕猴浆母细胞抗体筛选难度大61-62
• 4.1.3 单细胞PCR筛选抗体的技术可靠性62
• 4.2 结论62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-71
• 附录71-81

  本文关键词：利用单细胞PCR从免疫后中国猕猴筛选H7N9高亲和力中和抗体，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：453053