PD-L1高表达的大鼠髓源性树突状细胞的体外诱导培养与鉴定

发布时间：2017-06-19 03:08

  本文关键词：PD-L1高表达的大鼠髓源性树突状细胞的体外诱导培养与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：树突状细胞(Dendritic Cell,DC)是目前公认功能最强的专职抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APCs),它在特异性免疫应答的激发和调节中起着关键性的作用[1,2]。DC主要由骨髓多能干细胞的髓系前体—骨髓单个核细胞(Bone Marrow Mononuclear Cell,BMMC)分化而来[3,4]。在机体的免疫应答过程中,DC正是通过调节其正性或负性共刺激分子与粘附分子的表达(即协同刺激信号),调控机体在接受抗原刺激后,是发生特异性免疫反应还是诱导免疫耐受。PD-L1/PD-1(Program Death 1,PD-1;Program Death Ligand 1,PD-L1)作为外周免疫耐受中最重要的负性共刺激信号通路之一,在器官移植术后移植物的免疫排斥与耐受的调节过程中起着重要作用[5]。本实验通过细胞因子诱导的“鸡尾酒”培养法诱导大鼠骨髓源树突状细胞(Myeloid-derived Dendritic Cell,MDDC)高表达负性共刺激分子PD-L1,获得PD-L1高表达的树突状细胞,即PD-L1highDC。同时,探索其体外诱导培养的最适宜条件,构建高效、实用的免疫耐受性DC,并对其进行细胞形态学、分子表型和功能鉴定。虽然大鼠MDDC的培养方法已经比较成熟,但如何有效地诱导其高表达负性共刺激分子PD-L1,国内外研究甚少,我们成功地探索出一条细胞因子“鸡尾酒”培养刺激方法,获得PD-L1highDC,为体内诱导移植免疫耐受研究打下了扎实地基础。目的:探索一种简单高效的PD-L1high DC诱导培养方法,为经由PD-L1/PD-1负性共刺激信号通路诱导抗原特异性的移植免疫耐受的体内实验研究打下基础。方法： 1.实验分组如下:GM-CSF诱导组、经典DC诱导组、“鸡尾酒”法诱导组。无菌技术收集大鼠骨髓细胞,密度梯度离心法纯化获得BMMC,“鸡尾酒”培养法添加细胞因子GM-CSF、IL-4、IFN-γ诱导、培养DC,第8天加入LPS促其成熟。2.培养期间,倒置显微镜观察DC的生长状态,相差显微镜和扫描电镜拍照记录其形态学特征。收集成熟DC,流式细胞仪检测鉴定其表面分子标记物表达情况;同种异体的混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)鉴定其细胞生物学功能。结果： 1.各均能成功诱导获得典型的DC,且各组DC细胞的形态学上无明显差别。经典DC诱导组和“鸡尾酒”法诱导组DC的产量和纯度均在80%以上,并且在“鸡尾酒”法诱导组中,10ng/m L的IFN-γ浓度为诱导收获高纯度PD-L1highDC的最适宜浓度。2.DC表面分子流式鉴定显示:经典DC与PD-L1highDC相比,DC特征性表面分子MHC-Ⅱ(68.86±3.46 VS 20.34±1.71)%、PD-L1(2.00±0.36VS 82.26±6.43)%有明显统计学差异(P0.001)。3.MLR显示:PD-L1highDC与经典DC细胞相比,其刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力明显降低,两组比较有统计学差异(P0.05)。结论： 1.“鸡尾酒”诱导法(即GM-CSF+IL-4联合IFN-γ)可成功诱导收获大量高表达PD-L1的DC,与经典DC对比,在形态学上无明显差别。2.“鸡尾酒”法诱导培养条件下,10ng/m L的IFN-γ浓度为诱导、培养高纯度PD-L1highDC的最适宜浓度。3.与经典DC对比,PD-L1highDC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力显著下降,显示出其抑制性DC的细胞生物学特性。4.PD-L1highDC表面MHC-Ⅱ表达与经典DC对比,存在明显统计学差异,推测MHC-Ⅱ表达下调是PD-L1highDC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力显著下降的原因之一。5.本实验探索出了一条简单高效的PD-L1high DC诱导培养方法,为经由PD-L1/PD-1负性共刺激信号通路诱导抗原特异性的移植免疫耐受的体内实验研究打下基础。
【关键词】：树突状细胞 PD-L1 PD-1 免疫耐受 器官移植
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.4;Q813
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-14
• 前言14-18
• 材料与方法18-31
• 结果31-37
• 讨论37-45
• 结论45-46
• 参考文献46-52
• 综述：PD-1 在移植免疫耐受中的作用及应用研究进展52-63
• 参考文献59-63
• 附录63-64
• 个人简历64-65
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴海竞;张光波;胡玉敏;明志君;张学光;;PD-1在器官移植患者T细胞上的表达及其意义[J];南京医科大学学报(自然科学版);2008年10期

  本文关键词：PD-L1高表达的大鼠髓源性树突状细胞的体外诱导培养与鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：461415