西尼罗病毒非结构蛋白NS1特异性单克隆抗体的制备及应用

发布时间：2017-06-21 04:03

  本文关键词：西尼罗病毒非结构蛋白NS1特异性单克隆抗体的制备及应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：当今,新发病毒性传染病不断出现,我国南方如广东、广西、海南等地由于地处热带亚热带地区,全年平均气温高,气候湿热,特别适合于各种虫媒性病原体的繁殖,成为急性虫媒病毒性传染性疾病的自然疫源区和发生地。西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)属黄病毒科黄病毒属中乙型脑炎病毒的血清群[1,21,主要在蚊-鸟-蚊的循环中进行繁殖,并通过蚊虫特别是库蚊传播给人类,引发西尼罗热和西尼罗脑炎。西尼罗热于1937年首次暴发于乌干达[3],随后迅速传播到非洲、欧洲、美国、加拿大各地,已成为一种严重危害人类健康的蚊媒传播性病毒性传染病[4]。自1999年,该病毒首次登陆西半球,并迅速肆虐美国,截止2016年1月份,已经有41679例美国居民确诊为西尼罗病毒感染,其中,死亡病例高达1753例(http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/index.htm),是继炭疽事件之后又一种导致全美恐慌的致病性微生物,被WHO列为当前全球重大流行病之一。近年来,该病毒在全球范围内仍呈继续扩散的趋势,加拿大、俄罗斯和以色列等国家也相继出现了人感染而死于西尼罗脑炎的报道。至今,我国虽未有西尼罗热爆发流行的报道,但我国拥有11种能够传播西尼罗病毒的蚊种。随着国际贸易和旅游业的快速及交通的便利,西尼罗病毒传入我国的危险日益增大。梁国栋等[6-7]通过对2004年和2011年新疆爆发的乙型脑炎病毒感染患者血清抗体的回归性分析发现,其中有部分患者血清中存在针对西尼罗病毒的中和抗体,该结果充分证实了我国已经有西尼罗病毒感染人群的迹象,虽然该病毒尚未在我国引起大规模爆发流行,但从西尼罗病毒席卷整个美国的凶险趋势,西尼罗病毒在中国大规模爆发流行是很难避免的。况且,对我国而言,西尼罗病毒是一种全新的致病病毒,全民普遍易感,人群中又没有免疫屏障,其危险性极大。因此,提前做好防范及相应的技术储备为我国应对西尼罗病毒的传入至关重要。然而,目前尚未有安全有效的西尼罗病毒疫苗,临床上针对西尼罗病毒感染也无有效的抗病毒药物及治疗措施,但近期发现,在感染早期给予特异性的抗体或者免疫球蛋白对西尼罗病毒感染具有较好的疗效[8-10]。因此,建立一种灵敏、特异的早期诊断方法,对早期发现传染源,及时治疗和阻断WNV的传播途径至关重要。而目前主要应用于西尼罗病毒感染诊断的方法包括核酸检测、血清学检测和病毒分离培养。虽然病毒分离培养是诊断西尼罗病毒感染的金标准,但病毒分离需要在三级生物安全实验室进行,很难达到早期诊断,更不利于基层单位的推广：RT-PCR等检测技术相对不稳定,受影响因素多,需要昂贵的仪器及熟练技术人员；尤其是WNV感染人类所引发的病毒血症期特别短、血中病毒载量也低等特点,容易出现假阴性结果[11-13]。而血清学检测方法是目前最常用于WNV感染诊断的方法,国际上也有很多基于IgM/IgG的商品化试剂盒,但抗体的产生至少需要3～4天的窗口期,因此仅检测抗体很难达到早期诊断的目的[14,15]。此外,由于西尼罗病毒与其他黄病毒特别是乙型脑炎病毒抗原存在严重交叉反应,很难区分既往感染或接种乙型脑炎病毒疫苗的患者,进一步限制了其在临床上的应用。因此,亟需建立一种有效的、特异的西尼罗病毒早期抗原诊断方法。近年两个基于免疫层析的商品化西尼罗病毒抗原检测试剂盒被应用于鸟类和蚊类分泌物中病毒抗原的检测,即VecTest西尼罗病毒E蛋白抗原检测试剂盒(USA)[17-20]和RAMP西尼罗病毒检测试剂盒(Canada)但这两个试剂盒检测WNV培养上清的敏感性只有105.17 PFU/ml和103.17 PFU/ml,蚊类标本检测的阳性率也分别只有94%and 65%,这对于病毒载量极低的患者血清来说,这种试剂盒的敏感性完全达不到所需标准。Young[22]和Macdonald[23]发现在DENV感染患者和WNV感染仓鼠血清中含有高浓度的NS1蛋白,该蛋白是一个高度保守的糖蛋白,是作为黄病毒抗原诊断方法的最佳靶标。Macdonald等和Chung等利用所建立的NS1抗原捕获ELISA证实了血清中NS1的检出明显早于IgM抗体,但由于其方法学的检测限只有0.5ng/ml,并且只能检测到病毒感染3天后血清标本中的NS1抗原,很难满足早期诊断的需求。此外,Macdonald等所建立的基于黄病毒属交叉型抗体的NS1捕获ELISA无法区分西尼罗病毒与其他黄病毒的感染。Saxena等利用西尼罗病毒NS 1特异性单抗和多抗建立的双抗体夹心检测方法能够很好地检测到WNV感染患者血清中的NS1抗原,同时具有WNV血清型特异性,说明利用抗WNV-NS1抗体建立检测方法可用于WNV感染的鉴别诊断。但由于该方法使用的捕获抗体为多克隆抗体,存在批间差异,不利于标准化和商品化。因此,为了建立一种敏感性更高、基于WNV-NS1蛋白的双单抗夹心抗原检测方法。本研究通过优化WNV-NS1蛋白的表达、纯化及复性条件,制备了一组特异性抗WNV-NS1蛋白的单克隆抗体,并对这组单抗的免疫学特性、识别抗原位点及其特异性进行鉴定,利用单抗识别抗原位点的专一性和双抗体夹心抗原捕获ELISA的原理,通过对单克隆抗体的优化组合,建立双抗体夹心NS1抗原捕获的ELISA方法,以期达到早期诊断西尼罗病毒感染的目的。此外,我们对NS1抗体与血小板的交叉反应现象进行了初步研究,为进一步探讨NS1蛋白及其抗体在西尼罗病毒发病机制中的作用奠定基础。针对我国目前尚未有任何关于西尼罗病毒诊断试剂的这一现状以及人类目前对西尼罗病毒的发病机制及其疫苗研制方面的难题,本研究主要通过以下四个部分进行：一、西尼罗病毒NS1蛋白的优化表达及抗原性鉴定在前期获得原核表达pGEX-5X-3/NS1质粒基础上,通过对重组西尼罗病毒NS1蛋白的表达条件、纯化条件及复性条件的进一步优化,成功获得了高纯度、可溶性的重组西尼罗病毒NS1融合蛋白。经Western Blot和间接ELISA鉴定,证实其可与4个血清型登革病毒NS1蛋白交叉性单抗和抗GST特异性单抗反应,具有良好的抗原性,为下一步研究西尼罗病毒免疫诊断试剂奠定基础。二、西尼罗病毒NS1蛋白血清型特异性单克隆抗体的制备及其鉴定本部分在前期获得具有良好抗原性和可溶性的WNV-NS1蛋白基础上,通过细胞融合技术,获得一组抗西尼罗病毒NS1蛋白特异性的单克隆抗体,并对所获得单克隆抗体的特异性、免疫学特性及所识别抗原位点的分析。采用重组NS1蛋白对小鼠进行多次皮下和腹腔交替免疫。免疫四次后,取抗体效价高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(NS-1)融合,以重组GST蛋白和西尼罗病毒NS1蛋白为包被抗原进行ELISA初筛,免疫荧光(IFA)复测,利用有限稀释法对复测阳性的细胞株克隆进行亚克隆化,最终获得65株能够稳定分泌抗NS1蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。65株单抗的Ig亚类测定显示IgG1单抗46株,IgG2a单抗8株,IgG2b单抗9株,IgG3单抗2株。IFA和间接ELISA鉴定有26株单抗与4型登革病毒或乙型脑炎病毒有交叉反应；其余的39株单抗均与西尼罗病毒NS1蛋白特异结合,与4个血清型登革病毒、乙型脑炎病毒和黄病毒均无交叉反应,确定为西尼罗病毒血清型特异性。采用单抗间竞争抑制试验对53株腹水型单抗所识别抗原位点的分析,结果表明,39株WNN-NS1特异性单抗至少识别13个以上不完全相同的抗原位点,14株交叉型单抗至少识别8个以上不完全相同的抗原位点,本部分研究结果为下一步建西尼罗病毒NS1抗原检测方法提供了必要的奠定基础。三、西尼罗病毒NSl抗原检测方法的建立及应用在获得39株WNV-NS1单抗所识别抗原表位基础上,根据单抗识别抗原位点的专一性,对39株WNV-NS1蛋白特异性单抗进行组合配对以筛选出最佳的捕获抗体和检测抗体组合。即用辣根过氧化物酶对每一株单抗进行标记,以未标记的39株单抗作为捕获抗体分别与其所识别不同抗原表位的HRP标记的单抗作为检测抗体进行两两组合配对,通过分析检测NS1蛋白和西尼罗病毒培养上清的敏感性及特异性,并结合正常人血清标本的检测结果,经多次重复筛选,最终确定了以单抗WNV-M4为捕获抗体,HRP-WNV-M6为检测抗体构建检测体系。该方法检测重组WNV-NS1蛋白的敏感性为15pg/ml,其线性检测范围为15.62到125ng/ml,明显高于Saxena等报道的0.5ng/ml,可望成为定量分析试剂。该体系的特异性鉴定显示所建立的双抗体夹心抗原捕获法仅特异性的检测到西尼罗病毒,其检测限为61pfu/ml,而与黄病毒其他成员如乙型脑炎病毒、登革病毒、黄热病毒和森林脑炎病毒均无交叉反应。此外,通过对1003例正常人血清标本的检测确定了方法学的临界值,并以此标准对107份采集自2006年广东省登革热流行区确诊为Ⅰ型登革病毒感染且DV1-NS1抗原阳性的患者血清进行检测,无一阳性反应。对WNV感染小鼠血清检测中发现,本体系能检测到病毒感染第1天小鼠血清中的NS1蛋白,且随着感染时间的延长,NS1蛋白的浓度逐渐升高,在感染第4天达到高峰,随后逐渐降低,第6天NS1蛋白的含量已明显降低,该结果与Chung等的研究结果一致。尤其是对病毒感染第1-4天小鼠血清中NS1蛋白的检出率由85.7%升至5-7天的100%,对于病毒感染7天内小鼠血清标本检测的敏感性明显高于实时RT-PCR检测方法(P=0.035)。以上结果表明本研究所建立的方法不仅具有西尼罗病毒血清型特异性,同时能够检测到感染第1天到第7天小鼠血清中的NS1蛋白,有望成为西尼罗病毒感染早期诊断的工具。四、抗西尼罗病毒NSl抗体与血小板的交叉反应初探已知同属黄病毒的登革病毒感染可出现血小板减少及出血热,且与抗NS1抗体有关。而近年也有两例西尼罗病毒患者出现重症出血的报道,但目前国内外尚未见到有关抗西尼罗病毒NS1抗体结合血小板或影响血小板功能的报道。考虑到西尼罗病毒NS1蛋白与登革病毒NS1蛋白具有高度同源性,那么是否西尼罗NS1单抗也能结合血小板并影响其功能?据此,我们通过间接ELISA\流式细胞术和免疫印迹分别对所获得的51株NS1单抗与血小板的结合情况做了相关鉴定,结果显示,51株单抗中间接ELISA检测与血小板结合的单抗有16株,流式细胞术阳性的单抗有19株,ELISA和流式同时阳性的12株,免疫印迹法鉴定ELISA和流式同时阳性的12株单抗和2株单独流式阳性的单抗与血小板蛋白的结合则只有8株单抗有阳性反应条带,其他6株单抗均为阴性,推测该6株单抗识别的可能是构象型表位的血小板蛋白,以至于无法与加热变性后的血小板蛋白成分结合。本部分研究结果将为进一步揭示NS1蛋白及其抗体在WNV发病机制及疫苗研发等提供理论依据。综上,本研究成功制备了具有良好抗原性和可溶性的重组西尼罗病毒NS1蛋白,并以该重组蛋白作为免疫原免疫小鼠获得了65株具有NS1蛋白特异性的单克隆抗体,经间接ELISA和IFA鉴定,其中39株为西尼罗病毒NS1蛋白特异性单抗,26株单抗分别与4个血清型登革病毒和乙型脑炎病毒存在不同程度的交叉反应。利用以上获得的39株WNV-NS1特异性单抗进行配对筛选建立了双抗体夹心抗原捕获ELISA法,该方法不仅能检测到急性期小鼠血中的NS1蛋白,而与黄病毒属其他成员如乙型脑炎病毒、4个血清型登革病毒、森林脑炎病毒及黄热病毒均无交叉反应；可在感染第1-7天检出NS1蛋白,适用于西尼罗病毒感染的早期诊断。与国外同类研究比较本体系敏感性高,检出时间早,覆盖感染后时间范围长,有望应用于西尼罗病毒的早期诊断及鉴别诊断。此外,初步鉴定了部分西尼罗病毒NS1单抗与人血小板的反应性,为研究NS1抗体在WNV感染发病机制中的作用及制定疫苗研制策略提供理论依据与参考。
【关键词】：西尼罗病毒 非结构蛋白1 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验 血小板反应性
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 第一章 西尼罗病毒重组NS1蛋白的表达及抗原性鉴定18-31
• 1.1 材料和方法18-26
• 1.2 结果26-29
• 1.3 讨论29-31
• 第二章 西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定31-52
• 2.1 材料和方法31-39
• 2.2 结果39-50
• 2.3 讨论50-52
• 第三章 WNV-NS1蛋白检测方法的建立与优化52-64
• 3.1 材料和方法52-56
• 3.2 结果56-61
• 3.3 讨论61-64
• 第四章 抗西尼罗病毒NS1抗体与血小板的交叉反应初探64-77
• 4.1 材料和方法65-70
• 4.2 结果70-74
• 4.3 讨论74-77
• 参考文献77-82
• 中英文缩略82-84
• 在读期间发表及待发表的文章84-86
• 在读期间所获奖励及支助86-87
• 致谢87-88

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