冻融—冻干法制备狂犬疫苗脂质体及其细胞免疫研究

发布时间：2017-06-30 00:01

  本文关键词：冻融—冻干法制备狂犬疫苗脂质体及其细胞免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒感染所致的以损害中枢神经系统为主的急性传染病,属于人兽共患的自然疫源性疾病,一旦发病,病死率几乎100%。目前应用狂犬疫苗接种是预防狂犬病的有效方法。传统的灭活狂犬疫苗虽然具备了制作工艺简单的特点,但仍存在灭活过程中有可能改变有效的抗原决定簇、免疫应答时间不长、需要多次免疫等问题；铝佐剂疫苗虽然在一定程度上克服了以上缺点,但存在产生抗体迟缓、副反应多等缺点,因此,寻找能使机体较早产生抗体且能增强细胞免疫的安全疫苗佐剂成为现今研究狂犬疫苗的热点。本课题以脂质体作为疫苗佐剂,采用薄膜分散联合冻融-冻干法,在已确定的制备狂犬疫苗脂质体最优工艺的基础上,制备了一批狂犬疫苗脂质体冻干粉,并考察其粒子状态、粒度分布和包封率；将狂犬疫苗脂质体混悬液和冻干粉置于4℃、25±2℃和37±2℃条件下进行物理稳定性试验,不同的时间点取样,以显微观察外观和包封率为指标考察其稳定性；脂质体包封率为(85.29±2.43)%(n=5),在MoticB5型数码电子显微镜(Oil, 100x)下观察,其形态呈圆形或椭圆形,粒度分布均匀,平均粒径为3.89μm;在脂质体物理稳定性考察中,4℃和25±2℃储存条件下,脂质体冻干粉30天内的包封率仍下降不明显,表明冻干粉的稳定性较好。将疫苗原液分别稀释成4倍、6倍和8倍,然后制成脂质体冻十粉,分别免疫小鼠并筛选出最佳稀释倍数,4倍稀释脂质体的细胞刺激指数较高,选择其为最佳稀释倍数；用疫苗原液、疫苗脂质体、最佳稀释倍数脂质体分别腹腔三针免疫清洁级KM小鼠,抗原给药量相同,生理盐水作为对照,28天后以细胞免疫考察其免疫原性,包括体外实验MTT法检测淋巴细胞增殖能力和流式细胞仪检测淋巴细胞表面标记。结果显示,疫苗原液组、疫苗脂质体组、4倍稀释组与空白对照组比较,均能刺激机体产生细胞免疫(P0.05)；疫苗脂质体组和疫苗原液组之间SI值差异有显著意义(t=11.483,P0.05),4倍稀释组和疫苗原液组之间SI值差异有显著意义(t=-15.931,P0.05),4倍稀释组和疫苗脂质体组之间SI值差异有显著意义(t=-8.537,P0.05),表明狂犬疫苗脂质体和4倍稀释疫苗脂质体免疫机体诱导其产生的细胞免疫水平明显高于疫苗原液,且疫苗4倍稀释疫苗脂质体优于狂犬疫苗脂质体。疫苗原液组、疫苗脂质体组和4倍稀释组小鼠CD4+/CD8+比值与对照组比较,P值均小于0.05,表明疫苗原液、疫苗脂质体和原液4倍稀释脂质体都能刺激机体产生细胞免疫,狂犬疫苗脂质体组与疫苗原液组之间CD4+/CD8+比值差异有显著意义(t=11.288,P0.05),4倍稀释组和疫苗原液组之间CD4+/CD8+比值差异有显著意义(t=-9.067,P0.05),4倍稀释组和疫苗脂质体组之间CD4+/CD8+比值差异有显著意义(t=4.789,P0.05),表明狂犬疫苗脂质体和原液4倍稀释脂质体免疫机体诱导其产生的细胞免疫水平明显高于狂犬疫苗原液,且原液4倍稀释脂质体优于狂犬疫苗脂质体,也表明狂犬疫苗脂质体可增强机体的细胞免疫。以上结果说明冻融-冻干法是一种可行的制备狂犬疫苗脂质体的工艺;该方法制备的狂犬疫苗脂质体免疫诱导机体产生的细胞免疫水平明显高于狂犬疫苗原液,且疫苗4倍稀释后制备的脂质体优于狂犬疫苗脂质体。脂质体作为佐剂的狂犬疫苗可增强机体的细胞免疫。
【关键词】：冻融-冻干法 Vero细胞狂犬疫苗 脂质体 稳定性 细胞免疫
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 缩略词表(以字母顺序排列)6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 前言12-18
• 1. 狂犬病概述12-13
• 2. 狂犬疫苗应用现状13-15
• 3. 脂质体狂犬疫苗研究现状15-17
• 4. 本课题设计17-18
• 第二章 冻融-冻干法制备狂犬疫苗脂质体及其理化性质的研究18-31
• 1. 材料18-19
• 1.1 狂犬病疫苗18
• 1.2 实验试剂18-19
• 1.3 实验主要仪器设备19
• 2. 方法19-23
• 2.1 冻融-冻干法制备狂犬疫苗脂质体19-21
• 2.1.1 薄膜分散法制备空白脂质体20
• 2.1.2 超声法制备单层脂质体20-21
• 2.1.3 冻融法制备狂犬疫苗脂质体21
• 2.1.4 冷冻干燥法制备狂犬疫苗脂质体冻干粉21
• 2.2 狂犬疫苗脂质体的形态观察与粒度分析21
• 2.3 Lowry法测定狂犬疫苗脂质体的包封率21-23
• 2.3.1 标准溶液的配制22
• 2.3.2 蛋白含量测定的标准曲线绘制22-23
• 2.3.3 狂犬疫苗原液蛋白含量的测定23
• 2.3.4 狂犬疫苗脂质体蛋白含量的测定23
• 2.4 狂犬疫苗脂质体物理稳定性考察23
• 3. 结果23-29
• 3.1 狂犬疫苗脂质体冻干粉的形态观察与粒度分布23-25
• 3.2 狂犬疫苗脂质体包封率测定结果25-27
• 3.3 狂犬疫苗脂质体物理稳定性考察27-29
• 4. 讨论29-31
• 4.1 冻融-冻干法制备脂质体的特点29
• 4.2 冷冻干燥技术能提高脂质体的稳定性29-31
• 第三章 狂犬疫苗脂质体细胞免疫研究31-44
• 1. 材料32-33
• 1.1 狂犬病疫苗32
• 1.2 实验试剂32
• 1.3 实验动物32
• 1.4 实验主要仪器设备32-33
• 2. 方法33-36
• 2.1 脾淋巴细胞转换实验(MTT)33-34
• 2.1.1 淋巴细胞转换实验试剂配制33-34
• 2.1.2 脾淋巴细胞悬液的制备34
• 2.1.3 MTT法检测细胞增殖34
• 2.2 预实验动物分组34-35
• 2.3 正式动物分组35
• 2.4 T淋巴细胞表面标记实验35-36
• 2.4.1 脾淋巴细胞悬液的制备35
• 2.4.2 动物分组35
• 2.4.3 流式细胞仪检测T淋巴细胞表面标记实验35-36
• 3. 结果36-43
• 3.1 预实验小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果36-37
• 3.2 正式实验小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果37-38
• 3.4 小鼠T淋巴细胞免疫标记38-43
• 4. 讨论43-44
• 全文小结44-45
• 参考文献45-48
• 第四章 综述 新型狂犬疫苗的研究进展48-57
• 1. 新型狂犬疫苗的分类49
• 2. 重组疫苗49-51
• 2.1 大肠杆菌为载体49
• 2.2 活病毒为载体49-50
• 2.3 非复制病毒或复制缺陷病毒为载体50
• 2.4 植物病毒或菌为载体50-51
• 3. 减毒活疫苗51-52
• 4. DNA疫苗52-53
• 5. 亚单位、多肽疫苗53-54
• 5.1 亚单位疫苗53
• 5.2 多肽疫苗53-54
• 6. 展望54-55
• 参考文献55-57
• 攻读学位期间获得的学术成果57-58
• 致谢58

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