树突状细胞疫苗联合百白破疫苗对哺乳动物乳腺癌模型细胞治疗的研究

发布时间：2017-07-28 10:34

  本文关键词：树突状细胞疫苗联合百白破疫苗对哺乳动物乳腺癌模型细胞治疗的研究

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【摘要】：癌症是一种致命性的疾病,由于癌细胞的无限增殖以及癌细胞的恶性转移使癌症成为医学领域的一大难题。乳腺癌是一种发生率较高的女性疾病,发生部位为乳腺腺上皮组织,是一种比较普遍的恶性肿瘤,而且对女性群体的身心健康有着很大的影响。由于乳腺癌细胞之间的粘着性降低,使得其高分散、高转移,其正常细胞的特性被破坏。近年来,乳腺癌在全球的发病率迅速增长、死亡率明显升高,使得全球各个国家高度重视乳腺癌所带来的巨大影响,因此针对该病进行有效的治疗己成为科研工作者比较重视的课题。树突状细胞具有摄取抗原的能力,同时也可以加工抗原。树突状细胞可以将抗原提呈到T细胞的表面,然后诱导T细胞免疫应答。树突状细胞的抗原递呈能力是最强大的。DCs疫苗首先是把单核细胞在体外培养,加入各种各种细胞因子诱导成DCs,然后将DCs负载上相应的肿瘤抗原之后就制成DCs疫苗。注射DCs疫苗可以治疗肿瘤,肿瘤杀伤性淋巴细胞可以被DCs疫苗激活,并且大量增殖,从而监视体内的微环境、杀伤肿瘤细胞。目前体外大批量扩增DCs以及制备DCs疫苗技术的逐渐成熟。将DCs疫苗应用于肿瘤治疗是一项极有发展潜力的方法,DCs疫苗在生物免疫治疗领域获得了较高的关注,逐渐成为焦点。DCs疫苗可以增强病人的免疫系统,DCs疫苗也能调控免疫反应,因此作为免疫疗法治疗癌症的免疫疗法。隧DCs生物学及功能学研究的进步推动DCs疫苗在治疗癌症方面的发展。DC是骨髓细胞在细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4的诱导下形成的。DCs前体细胞在rmGM-CSF的诱导下慢慢地向DCs方向分化、向DCs方向增殖。在GM-CSF的诱导下,DCs前体细胞逐渐地分化、增殖成为DCs集落。rmIL-4抑制细胞向巨噬细胞方向分化。rmTNF-α可以使不成熟的DCs转化为成熟的DCs。DCs疫苗注射到体内后,可以使产生大量的细胞因子如IL-12,激发免疫应答。免疫佐剂具有非特异性,是一种免疫增生剂。将免疫佐剂自身不具有抗原性,预先注射到体内或者和抗原一起注射到体内之后,可以使免疫反应的类型发生改变或者使免疫原性增强。研究表明,免疫佐剂可以提高DCs的免疫应答,也可以增强记忆性免疫。DCs扮演免疫系统的哨兵的角色,通过监督免疫环境和抗原识别。DCs可以被免疫环境中的危险信号激活,DCs接触抗原以后,通过血管迁移至淋巴结,参与T细胞免疫应答。部分免疫佐剂能够提高有机体的免疫水平,通过大量分泌细胞因子。百白破疫苗可以预防一下三种疾病——破伤风、白喉、百日咳。它是由百日咳、白喉、破伤风组成的脱毒疫苗,是这三种类毒素按照一定的比例配制成的。本试验使用的免疫佐剂是吸附无细胞百白破疫苗(ADPT)。肿瘤生物免疫疗法,DCs肿瘤疫苗是一种开启了新型的肿瘤免疫之门,DCs免疫疗法是一种发展潜力巨大无比的肿瘤治疗方案。国内外将DCs疫苗用于乳腺肿瘤治疗的研究并不多见,尤其针对乳腺癌的早期治疗。本实验使用的细胞系为4T1小鼠乳腺癌细胞株,将其接种在BALB/c小鼠的右侧乳房垫以建立肿瘤模型,体外将骨髓来源的单个核细胞诱导成DCs,再加入肿瘤抗原裂解物使DCs负载上抗原,促进DCs成熟。观察DCs疫苗对小鼠乳腺癌的治疗效果。同时进一步了解联合免疫佐剂使用的抑瘤效果,以及注射吸附无细胞百白破疫苗产生免疫记忆的小鼠联合DCs疫苗使用对乳腺癌的治疗效果。本研究中,我们无菌取小鼠骨髓细胞,通过加入细胞因子体外培养诱导成树突状细胞,并用加入肿瘤抗原裂解物使DCs负载上抗原,促进DCs成熟。将4T1乳腺癌细胞皮下注射到BALB/c小鼠乳房垫即原位注射,建立乳腺癌肿瘤模型,并随机地把30只接种4T1细胞的BALB/c小鼠分成六组：PBS组、DCs疫苗组、ADPT组、DCs疫苗+ADPT实时组、ADPT回忆应答组、DCs疫苗+ADPT回忆应答组。一方面,我们检测百白破疫苗联合DCs疫苗是否比单纯使用DCs疫苗对乳腺癌是否有治疗效果。另一方面,我们提前给荷瘤小鼠注射百白破疫苗,使小鼠体内形成免疫记忆,再次对已经免疫过的小鼠接种ADPT联合DCs疫苗,观察其是否比单纯使用DCs疫苗以及使ADPT联合DCs疫苗实时治疗效果更佳。实验结果表明,无论是否提前注射ADPT,单独使用DCs疫苗都比单独使用ADPT对于乳腺癌的治疗效果更好。同时,百白破疫苗与DCs疫苗在抗肿瘤免疫中有正协同作用。ADPT联合DCs疫苗对小鼠乳腺癌有显著的作用,其治疗效果明显优于单独使用DCs疫苗或者单独使用ADPT。而提前注射ADPT后使小鼠产生免疫记忆后,再联合DCs疫苗对小鼠乳腺癌治疗效果最佳。本试验为早期乳腺癌的治疗提供了实验基础和依据,对肿瘤病情的发展有很大的技术支持。同时,对于肿瘤生物免疫治疗领域在临床方面的应用奠定了实验基础,并且可以为临床乳腺癌治疗提供了多元性综合治疗的思路。
【关键词】：乳腺癌 DCs疫苗 生物免疫治疗 百白破疫苗
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9;R-332
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 前言11-21
• 一、乳腺癌11-13
• 1、乳腺癌概述11-12
• 2、乳腺癌细胞4T112-13
• 二、DCs疫苗13-18
• 1、DCs疫苗的发展史13
• 2、树突状细胞13-14
• 3、致敏DCs14-15
• 4、DCs成熟15
• 5、DCs疫苗抗肿瘤的机制15-18
• 三、吸附无细胞百白破疫苗18-19
• 四、国内外研究进展及选题思路19-21
• 1、国内外研究进展19
• 2、国内外研究进展与存在的问题及设计思路19-21
• 材料方法21-34
• 一、主要试剂21
• 二、主要试剂的配制21-22
• 三、实验动物22
• 四、实验耗材22-23
• 五、主要设备和器材23-24
• 六、实验方法24-33
• 6.1 细胞培养传代与冻存24-26
• 6.1.1 细胞的复苏24
• 6.1.2 细胞培养24-25
• 6.1.3 细胞冻存25-26
• 6.1.4 台盼蓝染色及细胞计数26
• 6.2 肿瘤抗原裂解液的制备26-27
• 6.3 骨髓来源树突状细胞的提取27-29
• 6.4 检测小鼠骨髓来源的DCs IL-12水平29
• 6.5 DCs疫苗的复苏29-30
• 6.6 构建乳腺癌种瘤模型30
• 6.7 DCs疫苗联合ADPT对小鼠乳腺癌的治疗效果30-33
• 6.7.1 收集小鼠血清31
• 6.7.2 检测血清中IL-4的表达水平31
• 6.7.3 检测血清中IFN-γ的表达水平31
• 6.7.4 测量肿瘤体积31
• 6.7.5 测量肿瘤质量31-33
• 实验流程图33-34
• 结果34-49
• 一、4T1细胞形态学34
• 二、DCs形态学34-36
• 三、小鼠骨髓来源的DCsIL-12水平36
• 四、4T1乳腺癌模型36-38
• 五、乳腺癌免疫治疗结果38-49
• 5.1 DCs疫苗联合ADPT对小鼠血清IL-4水平的影响38-40
• 5.1.1 DCs疫苗联合ADPT对各组小鼠血清IL-4水平的影响38-39
• 5.1.2 DCs疫苗联合ADPT与DCs疫苗组小鼠血清IL-4水平的比较39-40
• 5.2 DCs疫苗联合ADPT对小鼠血清IFN-γ水平的影响40-43
• 5.2.1 DCs疫苗联合ADPT对各组小鼠血清IFN-γ水平的影响40-42
• 5.2.2 DCs疫苗联合ADPT与DCs疫苗组小鼠血清IFN-γ水平的比较42-43
• 5.3 DCs疫苗联合ADPT对小鼠肿瘤体积的影响43-45
• 5.3.1 DCs疫苗联合ADPT对各组小鼠肿瘤体积的影响43-45
• 5.4 DCs疫苗联合ADPT对小鼠肿瘤质量的影响45-49
• 5.4.1 DCs疫苗联合ADPT对各组小鼠肿瘤质量的影响45-47
• 5.4.2 DCs疫苗联合ADPT与DCs疫苗组小鼠肿瘤质量的比较47-49
• 讨论49-51
• 参考文献51-55
• 致谢55-57
• 附录57

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