组胺受体H4R介导ERK信号通路分子机制与受体内吞定量分析方法的研究
本文关键词：组胺受体H4R介导ERK信号通路分子机制与受体内吞定量分析方法的研究
【摘要】：组胺受体隶属于G蛋白偶联受体超家族,在生物体的各个组织器官中都存在分布,参与调控机体各项生理功能。其中H4R为最新发现的一种亚型,它参与调节机体包括免疫与过敏反应在内的多种生理功能,有着巨大的研究潜力。本论文针对H4R调控胞内ERK1/2磷酸化所涉及的分子机制展开研究。利用多种特异性的抑制剂抑制相关蛋白的功能,然后检测胞内ERK1/2磷酸化水平的变化情况。最终确定了参与调控H4R介导的ERK1/2过程的蛋白。Ga蛋白以及Gβγ蛋白都能够影响H4R介导的ERK1/2磷酸化的过程。钙离子非依赖型的PKC,P13K相关蛋白也涉及其中。另外,H4R还能通过转激活途径激活ERK1/2。这为进一步研究H4R对生理功能影响的分子机制,打下了一定的基础。同时,本论文还改进了以DnaE为基础的受体内吞定量分析技术。基于GPCR与Rab5在内吞过程中的相互作用,设计出新的内吞定量检测方法。该方法适用面更广,灵敏度、可靠性高,能够更好的被应用于GPCR的相关研究。
【关键词】：H4R ERK 转激活 定量内吞 Rab5
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：
- 致谢5-6
- 摘要6-7
- ABSTRACT7-8
- 英文缩写词表8-12
- 1 综述12-32
- 1.1 组胺受体的研究发展12-18
- 1.1.1 H1R的发现与研究13-15
- 1.1.2 H2R的发现与研究15-16
- 1.1.3 H3R的发现与研究16-17
- 1.1.4 总结17-18
- 1.2 H4R的研究发展18-24
- 1.2.1 H4R的发现18-20
- 1.2.2 H4R的激动剂20-21
- 1.2.3 H4R的拮抗剂21-23
- 1.2.4 总结23-24
- 1.3 定量分析GPCR内吞的实验技术24-26
- 1.3.1 GPCR的内吞24-25
- 1.3.2 以DnaE为基础的定量内吞检测方法25
- 1.3.3 总结25-26
- 参考文献26-32
- 2 组胺H4R介导的ERK1/2信号通路分子机制研究32-56
- 2.1 实验材料33-35
- 2.2 实验方法35-40
- 2.2.1 质粒扩增与提取35-37
- 2.2.2 细胞培养、冻存与复苏37
- 2.2.3 细胞转染37
- 2.2.4 胞内Ca~(2+)的测定37-38
- 2.2.5 基于CRE报告基因的胞内cAMP的检测38
- 2.2.6 蛋白免疫印迹检测反洗磷酸化ERK1/238-40
- 2.3 实验结果40-51
- 2.3.1 H4R介导的浓度依赖性与时间梯度的ERK1/2的激活40-43
- 2.3.2 PTX对H4R介导的ERK1/2激活的影响43-44
- 2.3.3 Gβγ亚基在H4R介导的ERK1/2磷酸化过程中的作用44-45
- 2.3.4 PKC对H4R介导的ERK1/2磷酸化过程的影响45-49
- 2.3.5 PI3K、PDK1、Src对H4R介导的ERK1/2磷酸化过程的影响49-50
- 2.3.6 H4R通过转激活途径激活ERK1/250-51
- 2.4 讨论51-54
- 参考文献54-56
- 3 以DnaE与Rab5为基础的GPCR内吞定量分析56-72
- 3.1 实验材料58-60
- 3.2 实验方法60-64
- 3.2.1 目的基因载体的构建60-63
- 3.2.2 细胞培养、冻存与复苏63-64
- 3.2.3 细胞转染64
- 3.2.4 胞内荧光素酶活性的检测64
- 3.3 实验结果64-67
- 3.3.1 G蛋白偶联受体内吞的定量检测64-66
- 3.3.2 功能缺失型G蛋白偶联受体内吞的定量检测66-67
- 3.4 讨论67-70
- 参考文献70-72
- 作者简历72
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，本文编号：609824
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