干扰素γ对肥大细胞表达组织蛋白酶S的影响

发布时间：2017-08-02 14:01

  本文关键词：干扰素γ对肥大细胞表达组织蛋白酶S的影响

  更多相关文章： P815细胞系 小鼠骨髓源性肥大细胞 IFN-γ 组织蛋白酶S

【摘要】：研究背景组织蛋白酶S (cathepsin S, CTSS)是木瓜蛋白酶超家族的一种半胱氨酸蛋白酶,对多种蛋白具有催化水解活性。组织蛋白酶S有许多独特的功能,如参与MHC Ⅱ抗原提呈,特别是恒定链的降解。与其他类型半胱氨酸组织蛋白酶相比,组织蛋白酶S仅在特定组织表达,且在中性PH环境下仍具有活性。在多种抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)中均检测到组织蛋白酶S的表达,如B细胞、树突细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞等。组织蛋白酶S在多种生理及病理过程中均发挥了重要的调节功能,其过量或不适当激活与多种疾病的病理过程密切相关,如心血管疾病、哮喘、肿瘤、神经痛及多种自身免疫性疾病等。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血清及滑膜液中的组织蛋白酶S较正常人均有显著增加,但其浓度与疾病严重性是否相关仍存在一定的争议。组织蛋白酶S主要由类风湿关节炎关节的滑膜巨噬细胞表达,另有报道称软骨细胞也可能是组织蛋白酶S来源之一。组织蛋白酶S独特的组织分布局限性使其成为相关疾病理想的靶向治疗目标。研究者认为这种选择性抑制治疗可将潜在副作用降至最低。目前有一种用于治疗类风湿关节炎的组织蛋白酶S抑制剂药物在进行Ⅱ期临床试验;近期研究证实组织蛋白酶S抑制剂在动物实验中对狼疮肾炎有一定的治疗作用。肥大细胞(mast cells,MCs)是体内重要的免疫及炎症效应细胞。既往研究多集中在肥大细胞参与速发型过敏反应,2002年Lee等人研究发现肥大细胞在慢性炎症中也发挥着重要作用,尤其是自身免疫性疾病。肥大细胞活化后主要通过三种途径表达介质：一,细胞内颗粒含有大量预形成的介质(如组胺、蛋白酶、蛋白多糖、肝素),在细胞活化脱颗粒时快速释放；二,某些活化通路可以诱导脂质衍生的介质(如白三烯、前列腺素)释放；三,细胞活化诱导相关基因转录,促进某些细胞因子、趋化因子及生长因子的从头合成,并在活化后几小时内释放。病理条件下,肥大细胞可以被多种炎性因子活化,参与多种自身免疫性疾病的发病过程。Mallen-St Clair J等人在原代培养的小鼠骨髓源性肥大细胞(bone marrow mast cells,BMMCs)中检测到组织蛋白酶S的mRNA表达,并且利用25I]-JPM-乙基酯([125I]-JPM-ethyl ester)示踪检测到有活性的组织蛋白酶S,证明肥大细胞也是组织蛋白酶S的来源之一。干扰素Y(interferon-γ,IFN-γ)是标志性的Thl型细胞因子,可以促进CD4+Th细胞向Thl细胞的分化,并刺激白细胞介素2(interleukin 2, IL-2)、白细胞介素12(interleukin 12, IL-12)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等细胞因子的上调。自身免疫性疾病导致体内免疫紊乱时,自身反应性T细胞的过度增殖导致Thl/Th2细胞的失衡,血清IFN-γ水平升高,机体出现过度炎症反应。IFN-γ可通过激活Janus激酶／信号转导子与转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路启动细胞转录影响细胞功能,上调不同细胞中组织蛋白酶S的表达。用IFN-γ处理巨噬细胞后,组织蛋白酶S表达增加,且这种促进作用可被白细胞介素10 (interleukin 10,IL-10)阻断。用IFN--γ处理小神经胶质细胞后,组织蛋白酶S的表达量没有明显变化,但活性升高。目的目前仍缺乏炎性介质IFN-γ对肥大细胞表达组织蛋白酶S的影响方面的研究。因此,本实验拟利用IFN-γ刺激小鼠肥大细胞系P815细胞及原代培养的小鼠骨髓源性肥大细胞,观察其对肥大细胞表达组织蛋白酶S的影响。材料和方法1.材料P815小鼠肥大细胞系购自中国科学院细胞库,原代培养小鼠骨髓源性肥大细胞来自5周龄C57BL/6雄性小鼠,实验小鼠购自南方医科大学动物实验中心。2.P815小鼠肥大细胞系的培养P815细胞用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%青-链霉素的RPMI1640培养基于37℃、5%C02条件下培养。3.小鼠骨髓源性肥大细胞的培养选取5周龄C57BL/6雄性小鼠,颈椎脱臼法处死后,分离并剪断股骨、胫骨两端,置于含RPMI 1640的培养平皿中,用注射器抽取培养基冲洗骨髓腔至颜色发白,后接种于RPMI1640完全培养基(RPMI 1640含2.5 mmol/L L-谷氨酰胺,10%FBS,1%青-链霉素),再加入重组小鼠白细胞介素3(interleukin 3,IL-3),使其终浓度为lOng/ml,于37℃、5%CO2条件下培养。每三天换一次液,两周后追加重组小鼠干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),使其终浓度为20ng/ml,根据细胞生长情况,每五至七天换一次液。4.骨髓源性肥大细胞的甲苯胺蓝染色收集培养8周的骨髓源性肥大细胞,1500r/min离心4min,PBS洗涤2次,细胞涂片,自然风干,1%甲苯胺蓝染色1min,迅速用去离子水漂洗1次,显微镜下观察细胞染色情况。5.P815细胞及骨髓源性肥大细胞的刺激将处于对数生长期的P815细胞用不含FBS的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2条件下饥饿培养6 h。将饥饿处理后的P815细胞和培养8周的BMMCs调整细胞数为1×106个/ml后,接种于6孔板中。分别加入10、25、50ng/ml的IFN-y各培养24 h,以未加刺激的细胞作为阴性对照组,收集细胞及上清液。预实验发现用25、50ng/ml IFN-γ刺激对P815细胞及BMMCs表达CTSS的影响相似,故每孔加入25 ng/ml IFN-γ刺激细胞,P815细胞培养6、12、18、24、48、72 h；由于BMMCs培养周期长且细胞数量有限,故BMMCs仅选取预实验中探索到的3个有意义时间点12、24、48 h进行培养,每个时间点均以未加刺激的细胞作为阴性对照组,收集细胞及上清液。6.实时荧光定量PCR检测P815细胞及BMMCs CTSS mRNA的水平将以上实验中收集的P815细胞和BMMCs,按照说明书操作用RNAiso Plus提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定A260/A280的比值在1.8-2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行cDNA合成。按照TaKaRa公司SYBR(?)remix Ex TaqTM试剂盒说明书在LightCycler(?)480型荧光定量PCR扩增仪进行定量检测cDNA。PCR反应条件：95℃变性30s、95℃5s、60℃30s,循环40次。95℃5 s,60℃融解60s,50℃降温30 s。每组设置3个复孔。融解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。每个样品目的基因扩增的循环数(threshold cycle, Ct)都依据内参进行校正,得出ACt(Ct目的基因-Ct内参)。目的基因表达差异=2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt处理样品-ACt未处理样品)。7. ELISA检测P815细胞及BMMCs上清液中CTSS蛋白的水平以上实验中收集的上清液按照小鼠CTSS ELISA试剂盒说明书检测CTSS蛋白浓度。8.统计学处理所有数据采用均数士标准差表示,用SPSS20.0软件处理,两个样本均数间比较采用t检验,多个样本间均数比较采用单因素方差分析,均数间两两比较,方差齐性时用LSD法,方差不齐时用Dunnett's法。P0.05时认为差异有统计学意义。结果1.原代培养8周骨髓源性肥大细胞形态学观察以及骨髓源性肥大细胞甲苯胺蓝染色光镜下的BMMCs培养24 h后开始出现不规则形状的贴壁细胞,视野中可见大小不一的悬浮细胞。随着换液次数的增加,贴壁细胞数量减少,培养基中逐渐仅剩大小形态均一的悬浮细胞。甲苯胺蓝染色液呈蓝色,由于肥大细胞碱性颗粒的异染性,其所显示的颗粒颜色与染料颜色存在差异,肥大细胞颗粒被染成紫红色,而各种细胞核若被着色则呈现蓝色。实验中发现甲苯胺蓝染色后,可见细胞胞浆中的颗粒被染成紫红色。2.P815细胞和BMMCs经不同浓度的IFN-γ刺激后CTSS的mRNA及蛋白表达水平实时荧光定量PCR检测所收集细胞的CTSS mRNA水平,结果显示,与对照组相比,IFN-7刺激P815细胞及BMMCs后,CTSS mRNA的表达量均升高(P0.05),且这种刺激作用随IFN-y浓度的升高而增加(P0.05)。ELISA检测所收集细胞培养上清液的CTSS蛋白水平,结果显示,除10 ng/ml IFN-y刺激P815细胞后上清液中CTSS浓度与对照组相比无差异(P0.05),其余各组Ⅱ EN-γ刺激P815细胞及BMMCs后上清液中CTSS浓度均升高,差异有统计学意义(P0.05),且这种刺激作用随IFN-7浓度的升高而增加。但25 ng/ml与50ng/ml IFN-γ刺激P815细胞相比,上清液中CTSS浓度无差异(P0.05)。3.25ng/ml的IFN-y刺激P815细胞和BMMCs作用不同时间后CTSS的mRNA及蛋白表达水平实时荧光定量PCR检测所收集细胞的CTSS mRNA水平,结果显示,P815细胞经25ng/ml的IFN-y刺激12 h后,CTSS的mRNA表达量增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05),此后随时间延长,mRNA表达量逐渐升高,24 h时达到顶峰后开始下降,72 h时与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。BMMCs经25 ng/ml IFN-y刺激12h后,CTSS mRNA表达量增加,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),24 h时达到顶峰,48 h时下降。ELISA检测所收集细胞培养上清液的CTSS蛋白水平,结果显示,未经IFN-γ刺激的P815细胞及BMMCs上清液中均含有CTSS。P815细胞经25ng/ml的IFN-γ刺激12h后,上清液中CTSS浓度增加,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),此后浓度呈上升趋势,48h时达到顶峰后下降,但6h、18h和72h刺激组与对照组相比差异均无统计学意义(P0.05)。BMMCs经25 ng/ml IFN-γ刺激12h后,上清液中CTSS浓度增加,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),浓度于48h时达到顶峰。结论IFN-γ可增加肥大细胞CTSS的mRNA和蛋白水平,并具有一定的时间、剂量依赖关系。
【关键词】：P815细胞系 小鼠骨髓源性肥大细胞 IFN-γ 组织蛋白酶S
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-32
• 1. 组织蛋白酶S18-24
• 2. 肥大细胞24-29
• 3. IFN-γ29-32
• 材料与方法32-46
• 1.1 实验材料32-34
• 1.2 主要试剂与配制34-38
• 1.3 实验方法38-46
• 结果46-54
• 1. 原代培养8周BMMCs形态学观察以及BMMCs甲苯胺蓝染色46-47
• 2. 不同浓度及IFN-γ对P815细胞及BMMCs的CTSS MRNA表达的影响47-48
• 3. 不同浓度IFN-γ对P815细胞及BMMCs上清液中CTSS浓度的影响48-50
• 4. 25NG/ML的IFN-γ作用不同时间对P815细胞及BMMCs的CTSS MRNA表达的影响50-52
• 5. 25NG/ML的IFN-γ作用不同时间对P815细胞及BMMCs上清液中CTSS浓度的影响52-54
• 讨论54-58
• 全文小结58-59
• 参考文献59-71
• 缩略语词汇表71-73
• 攻读学位期间成果73-74
• 致谢74-76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王敏,张月琴;以组织蛋白酶K为靶点的新药筛选[J];中国抗生素杂志;2005年06期

2 刘贵秋;王玉学;;组织蛋白酶D与恶性肿瘤的侵袭和转移的相关性研究[J];中国肿瘤临床与康复;2007年06期

3 姬兴军;;皮肤损伤后人体皮肤组织蛋白酶K的动态变化分析[J];吉林医学;2011年18期

4 邵丽华;李雁;;组织蛋白酶B在肿瘤分子靶向治疗中的意义[J];武汉大学学报(医学版);2012年03期

5 姚琪远,邹强,倪泉兴,张延龄;组织蛋白酶D在甲状腺乳头状腺癌中的表达及其临床意义[J];中华实验外科杂志;2000年06期

6 庄世虹;成蓓;;粥样硬化动脉壁胶原含量和组织蛋白酶B的表达[J];微循环学杂志;2013年01期

7 胡瑜;肝细胞癌血清组织蛋白酶B抑制物的动态变化及其意义[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;1989年02期

8 任少华;组织蛋白酶B对人肺癌的预后意义[J];国外医学.呼吸系统分册;1995年01期

9 姚琪远,邹强,倪泉兴,张延龄;组织蛋白酶D在甲状腺乳头状腺癌中的表达及临床意义[J];外科理论与实践;1999年04期

10 姚琪远;组织蛋白酶D在甲状腺乳头状腺癌中的表达及临床意义(摘要)[J];上海医科大学学报;2000年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 谭宁华;曾广智;潘蓄林;贾锐锐;张玉梅;熊江;;组织蛋白酶天然抑制剂研究[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年

2 祁昕;刘彦斌;田树军;;组织蛋白酶对羊卵母细胞发育能力影响的研究进展[A];中国畜牧兽医学会养羊学分会2012年全国养羊生产与学术研讨会议论文集[C];2012年

3 钟婵;蔡秋凤;刘光明;曹敏杰;;蓝圆湽肌肉组织蛋白酶L及B的分离纯化及对肌原纤维蛋白质的分解作用[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年

4 雷健;;以组织蛋白酶为靶点的药物研究进展[A];第九届沈阳科学学术年会论文集（医药科学与生物技术分册）[C];2012年

5 王晓梅;刘保忠;;组织蛋白酶B对文蛤幼虫营养摄取具有重要调控作用[A];中国海洋湖沼学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

6 胡鑫;王新文;王勤涛;;组织蛋白酶C(CTSC)在正常小鼠组织中的表达模式观察[A];第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编[C];2014年

7 董悦生;林洁;路新华;郑智慧;马成伟;刘梅;白玉;张华;杨峻山;;邬氏黄丝曲霉产生的四个新组织蛋白酶抑制剂[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年

8 王晓梅;刘保忠;相建海;;组织蛋白酶B对文蛤幼虫生长变态的调控作用研究[A];中国动物学会、中国海洋湖沼学会贝类学分会第八次会员代表大会暨第十三次全国贝类学术讨论会论文摘要集[C];2007年

9 李春艳;陈永平;申春燕;陈少隆;林镯;;组织蛋白酶B在肝星状细胞HSC-T6中的动态表达和意义[A];第二十一次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2012年

10 王佳;赵玫;钟佳玲;杨梅;罗清;黄常志;;组织蛋白酶D对大肠癌侵袭与转移的影响[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2011年

中国博士学位论文全文数据库 前7条

1 李香;组织蛋白酶S活性调控小鼠缺血诱导的血管再生机制及冠心病患者血清中组织蛋白酶K的变化[D];延边大学;2015年

2 王雪迪;组织蛋白酶S(CTSS)对人肝癌细胞株MHCC97H药物敏感性的实验xO究[D];广西医科大学;2015年

3 原晓喻;组织蛋白酶K的高选择性肼腈类抑制剂的合成及效应检测[D];吉林大学;2016年

4 赵进军;组织蛋白酶S在类风湿关节炎中的作用[D];南方医科大学;2014年

5 李树红;鲢鱼背肌组织蛋白酶B、L的纯化鉴定及水解肌球蛋白的研究[D];中国农业大学;2004年

6 刘爱国;抑制组织蛋白酶B在心梗后心功能和纤维化中的作用及机制[D];山东大学;2013年

7 杨晓梅;棉铃虫个体发育过程中组织蛋白酶B的表达及功能研究[D];山东大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王津津;组织蛋白酶C在牙周炎症反应中的功能初探[D];第四军医大学;2015年

2 安平;组织蛋白酶B敏感的载药聚合物胶束研究[D];华东师范大学;2016年

3 王然;干扰素γ对肥大细胞表达组织蛋白酶S的影响[D];南方医科大学;2016年

4 鄢荣歆;组织蛋白酶L的高效表达[D];大连工业大学;2009年

5 杨远萍;家蚕组织蛋白酶基因家族结构分析及功能初探[D];西南大学;2006年

6 胡鑫;组织蛋白酶C在鼠、人组织中的表达研究[D];第四军医大学;2015年

7 刘玉欣;刺参（Stichopus japonicus）体壁组织蛋白酶L的组织化学定位研究[D];大连工业大学;2014年

8 谢志宙;旋毛虫组织蛋白酶B基因家族的克隆、表达及鉴定[D];中国农业科学院;2013年

9 申潞璐;胰岛素生长因子及组织蛋白酶B在慢性阻塞性肺疾病患者血液中的表达及临床意义[D];山西医科大学;2013年

10 常献娜;刺参（Stichopus japonicus）体壁组织蛋白酶L样蛋白酶的免疫组化研究[D];大连工业大学;2014年

，

本文编号：609596