EB病毒EBER2变异型通过PKR抑制鼻咽癌细胞凋亡的作用研究

发布时间：2017-08-08 04:01

  本文关键词：EB病毒EBER2变异型通过PKR抑制鼻咽癌细胞凋亡的作用研究

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【摘要】：背景和目的:EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)编码小RNA(EBV-encoded RNAs,EBERs,包括EBER1和EBER2)的致癌作用已在多种细胞系中得到证实。我们前期对EBERs基因多态性的研究中发现在EBER2基因发生6处共有突变的EB-8m变异型可能与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)尤其是高发区NPC的发生相关。以往有研究表明EBERs通过结合RNA激活蛋白激酶(RNA-activated protein kinase,PKR)并抑制其磷酸化从而抵抗干扰素-α(Interferonα,IFN-α)诱导的凋亡。本研究旨在明确变异型EBER2对NPC细胞增殖和IFN-α诱导细胞凋亡的作用,探讨其对PKR结合和磷酸化以及凋亡相关蛋白表达的影响,为明确EBER2及其变异型参与NPC的分子机制提供依据。方法:以只含EBER2基因的B95-8型和EB-8m变异型基因慢病毒稳定转染的EBV阴性NPC细胞系CNE1和HONE1为研究对象,进行细胞增殖实验和IFN-α细胞凋亡诱导实验;Western blot检测PKR、转录起始因子e IF2α和核转录因子c-Jun的磷酸化蛋白表达水平及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达情况;PKR基因瞬时转染EBER2阳性细胞后进行RNA蛋白结合免疫共沉淀,采用Real-time PCR和Western blot分别检测免疫共沉淀产物中EBER2 RNA和PKR蛋白水平。结果:(1)与转染原型EBER2细胞及转染载体病毒(不含EBER2)的对照细胞比较,转染变异型EBER2细胞MTT吸光度值和平板克隆形成率增高(P均小于0.05),原型和对照之间尚无差异。(2)转染原型和变异型EBER2细胞的细胞存活率高于对照细胞,凋亡细胞百分数低于对照细胞,差异均有显著性(P0.05),且转染变异型EBER2细胞凋亡百分数亦低于转染原型EBER2细胞,差异有显著性(P0.05)。(3)与转染对照病毒细胞及未转染细胞比较,转染原型和变异型EBER2细胞中磷酸化PKR、e IF2α和c-Jun表达下降,Bcl-2表达上调;转染变异型EBER2细胞较转染原型EBER2细胞磷酸化PKR表达下降更为明显。(4)原型和变异型EBER2均可与PKR发生免疫共沉淀,且EB-8m变异型EBER2在免疫共沉淀产物中的富集倍数高于原型EBER2,差异有显著性(P0.05)。结论:(1)EB-8m变异型EBER2可提高NPC细胞增殖及抗凋亡能力。(2)EBER2可通过结合PKR并抑制其发生磷酸化,同时抑制e IF2α和c-Jun磷酸化,上调Bcl-2蛋白表达而抵抗IFN-α诱导的细胞凋亡,EB-8m变异型EBER2可能增强EBER2与PKR的结合作用及对PKR磷酸化的抑制作用。
【关键词】：EB病毒 EBER2 PKR 细胞凋亡
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料与方法8-19
• 1.1 仪器、试剂和耗材8-10
• 1.2 慢病毒载体构建10
• 1.3 慢病毒转染目的细胞及稳定转染细胞筛选10-11
• 1.4 细胞增殖实验11
• 1.5 细胞凋亡诱导实验11-12
• 1.6 Western-blot检测蛋白表达12-13
• 1.7 RNA蛋白结合免疫共沉淀13-18
• 1.8 统计学分析18-19
• 第二章 结果19-28
• 2.1 EBERs基因结构及EB-8m变异型突变碱基位置19
• 2.2 稳定转染细胞EBER2基因表达19-21
• 2.3 EBER2原型和变异型基因对NPC细胞增殖的影响21-23
• 2.4 细胞凋亡诱导结果23-25
• 2.5 EBER2转染细胞中PKR、eIF2α、c-Jun以及Bcl-2 的表达情况25-26
• 2.6 pcDNA3.1-PKR-FLAG序列鉴定结果26-27
• 2.7 免疫共沉淀产物中EBER2 RNA和PKR蛋白检测27-28
• 第三章 讨论28-32
• 研究结论32-33
• 参考文献33-39
• 综述39-56
• 参考文献47-56
• 攻读学位期间的研究成果56-57
• 致谢57-58

【参考文献】

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1 杨万水;杨驰;郑家伟;高静;张薇;张志愿;项永兵;;上海市区鼻咽癌发病率趋势分析[J];中华流行病学杂志;2009年11期

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本文编号：638073