与OP9细胞共培养诱导人ES细胞向造血分化体系的研究
本文关键词：与OP9细胞共培养诱导人ES细胞向造血分化体系的研究
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【摘要】：背景:造血干细胞(HSC)是所有脊椎动物造血细胞形成的中心环节,移植后可完全重建造血功能,因此,同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗许多血液疾病(如白血病、地中海贫血、血液肿瘤)的关键。临床上,成体造血干细胞主要来源于骨髓及脐带血,而由于来源受限及免疫排斥极大地阻碍了造血干细胞的临床应用。胚胎干细胞(ES)为一类多能干细胞,在体外可无限扩增,且在特定条件下具有向造血干细胞分化的潜能,解决了细胞来源受限、免疫排斥等问题,为人类再生医学和个体化细胞替代疗法提供了无限的细胞来源。ES细胞体外诱导造血分化的研究是较为深入的领域之一。其中,OP9细胞是常用的用于诱导造血分化的基质细胞系,传统的共培养诱导周期约为2-3周,耗时长,本实验选用该诱导方法进行实验,通过探究最佳OP9细胞的接种密度,以达到缩短诱导分化周期的目的,优化体外造血分化体系。通过体外诱导造血分化的技术,建立人胚胎干细胞体外诱导造血分化的平台,为干细胞治疗奠定基础,也为研究造血细胞的发生生育的调控机制提供了依据。目的:探索OP9共培养诱导造血分化的最优条件,为体外诱导分化及机制研究建立平台。方法:传统的与小鼠骨髓间充质细胞OP9细胞共培养诱导造血分化,OP9细胞前期培养以及诱导分化过程的周期约为2-3周,我们利用本实验室已建系的人胚胎干细胞株HN14,将OP9细胞设置成实验组和对照组,实验组:OP9细胞密度设置6个梯度即1.5,2.5,3.5,5.0,6.5,8.0×105/ml接种至10cm皿培养24h后,即与HN14共培养诱导造血分化;对照组:应用传统方法,将OP9细胞按1.5×105/ml接种培养4天后,达到融合状态后进行共培养。通过观察形态变化、流式检测、实时荧光定量PCR及集落形成实验比较造血分化的效率。结果:无论是实验组还是对照组,镜下观察,ES细胞均出现不同程度地分化。采用流式细胞术检测共培养过程中第8、10、12天的CD34细胞阳性率,对照组在第12天达高峰,CD34的阳性率达10%左右,相较而言,在实验组中,CD34的阳性率提前2天达高峰,即在共培养第10天达高峰,且分化效率与对照组无差异(P值0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,中胚层的标志性基因BRACHYURY,呈现先升高后下降的趋势,在对照组在第6天达高峰,而实验组在第4天表达达高峰,这与CD34的表达高峰出现时间相一致。磁珠分选CD34+细胞进行集落形成实验,证实其具有向各系造血祖细胞分化的能力。本课题组实验结果表明,与传统的OP9细胞需培养4天后进行共培养的方法相比,以5.0-6.5×105/ml密度接种OP9细胞培养仅24h,共培养10天即可达到与对照组相似的分化效率,使诱导分化的周期足足缩短了3-5天,大大提高了分化效率。结论:1.利用与小鼠OP9基质细胞共培养的诱导体系,在本实验室建立了体外诱导造血分化的平台,为之后的机制性研究实验奠定基础。2.探究最佳OP9细胞接种密度,以5.0-6.5×105/ml接种OP9细胞24h后诱导分化效率与传统方法一致,缩短了造血分化的诱导周期,优化体外诱导造血分化体系。
【关键词】：人胚胎干细胞 OP9 细胞 共培养 造血干/前体细胞
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：
- 摘要4-7
- Abstract7-12
- 中英文对照表12-13
- 前言13-15
- 1 实验材料15-20
- 1.1 实验仪器15
- 1.2 实验耗材15-16
- 1.3 实验试剂16-17
- 1.4 试剂的配制17-18
- 1.5 试剂主要成分说明18-19
- 1.6 细胞株19-20
- 2 实验方法20-29
- 2.1 细胞株的冻融与传代20-22
- 2.2 人ES细胞与OP9细胞共培养定向诱导造血分化22-23
- 2.3 造血分化效率的评估与鉴定23-28
- 2.4 统计学处理方法28-29
- 3 实验结果29-40
- 3.1 人ES细胞及OP9细胞的培养及形态观察29-31
- 3.2 人ES细胞与OP9共培养定向诱导造血分化31-40
- 4 讨论40-45
- 4.1 体外有效诱导人ES细胞定向分化为造血干/前体细胞的建立40-42
- 4.2 体外诱导方法的改进42-43
- 4.3 展望43-45
- 5 结论45-46
- 参考文献46-49
- 综述 多能干细胞向造血干细胞分化的研究进展和应用前景49-65
- 参考文献58-65
- 个人简历及硕士期间发表论文65-66
- 致谢66
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，本文编号：645181
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