弓形虫毒力因子ROP18促进神经细胞凋亡的机制研究

发布时间：2017-08-11 06:55

  本文关键词：弓形虫毒力因子ROP18促进神经细胞凋亡的机制研究

  更多相关文章： 弓形虫 ROP18 内质网应激 凋亡 神经细胞

【摘要】：背景：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,简称弓形虫)是顶复门的细胞内专性寄生虫,几乎能感染所有的温血动物,可引起在世界范围内广泛传播的人兽共患寄生虫病。正常人感染弓形虫不会有明显症状,对于免疫功能不全的病人和胎儿,弓形虫病会引起严重感染,导致中枢神经、眼、心脏、肺和肝脏等疾病。在弓形虫感染的过程中,中枢神经系统是所有入侵器官中最普遍的,会引起婴儿小头畸形、脑积水和脉络膜视网膜炎等严重症状。ROP18是由弓形虫棒状体分泌的蛋白激酶,与虫体毒力密切相关,然而关于其对神经系统的作用机制尚不清楚。本研究中通过对感染ROP18高表达转基因弓形虫小鼠脑组织免疫荧光染色,发现ROP18促进神经细胞的凋亡。随后,通过流式细胞术、免疫印迹法等实验技术证实了ROP18是通过内质网应激途径促进神经细胞的凋亡。目的：探究弓形虫毒力因子ROP18对神经细胞凋亡影响,为弓形虫神经性侵害的分子机制研究奠定基础。方法：用OMIGA软件设计引物,构建ROP18-pEGFP-C2真核表达载体。组织免疫荧光染色观察小鼠脑组织神经细胞的变化,流式细胞术和免疫印迹方法检测神经细胞的凋亡及内质网应激途径中相关蛋白的表达。结果：1.成功构建ROP18-pEGFP-C2真核表达载体；Western blotting检测ROP18在N2a神经细胞中成功表达。2.高表达ROP18转基因弓形虫促进小鼠脑神经元的凋亡分别取感染ROP18转基因虫株、RH虫株小鼠和正常小鼠的脑组织,组织切片后做免疫荧光染色。共染鼠抗NeuN单克隆抗体(绿色),碘化丙啶PI(红色),DAPI(蓝色)。重叠图表明：在未感染的正常组中,大脑皮层是完整的,神经细胞数量较多且形态正常。相比于正常组,ROP18-RH虫株和RH虫株感染的小鼠大脑皮层和海马区的神经细胞明显减少。此外,ROP18-RH虫株感染的小鼠大脑皮层和海马区的凋亡神经细胞比RH虫株感染组明显增多。这些结果表明在感染弓形虫的小鼠模型中ROP18促进小鼠脑组织神经细胞的凋亡。3.ROP18促进N2a神经细胞的凋亡(1)分别将ROP18-GFP、14-3-3-GFP、GFP质粒转染至N2a神经细胞24小时后,流式细胞术检测发现ROP18-GFP的凋亡率明显高于对照组。(2)分别将高表达ROP18转基因虫株和RH虫株(1:3)感染N2a细胞24小时后,流式细胞术检测,显示感染高表达ROP18转基因虫株的N2a细胞凋亡率明显高于RH虫株感染组。4.ROP18通过内质网应激途径促进神经细胞的凋亡Western blotting检测发现转染ROP18-GFP质粒组和感染ROP18-RH虫株组明显增加了活化的Caspase-3、活化的Caspase-12和CHOP的表达水平,Z-ATAD-FMK (Caspase-12抑制剂)预处理后活化的Caspase-3和Caspase-12表达降低,CHOP的表达量没有明显变化。流式细胞术检测显示Z-ATAD-FMK预处理后转染ROP18-GFP质粒组和感染ROP18-RH虫株组的凋亡率减低。结论：本研究显示,弓形虫毒力因子ROP18可通过内质网应激(ER stress)途径促进神经细胞的凋亡,这为弓形虫神经性损伤的分子机制研究奠定基础。
【关键词】：弓形虫 ROP18 内质网应激 凋亡 神经细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7;R382.5
【目录】：

• 英文缩略词表(Abbreviation)7-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 1 前言15-17
• 2 实验材料17-22
• 2.1 细胞株、菌株、虫株17-18
• 2.2 质粒18
• 2.3 实验动物18
• 2.4 抗体18
• 2.5 主要试剂18-19
• 2.6 主要试剂溶液的配制19-21
• 2.7 主要仪器与设备21-22
• 3 实验方法22-34
• 3.1 弓形虫株的复苏与保种22-23
• 3.2 重组质粒的构建及提取23-29
• 3.2.1 引物设计及合成23
• 3.2.2 RH虫株速殖子总RNA的提取及cDNA的合成23-24
• 3.2.3 PCR扩增目的基因24
• 3.2.4 凝胶回收24-25
• 3.2.5 酶切25-26
• 3.2.6 连接26
• 3.2.7 TOP10感受态细胞的制备与质粒转化26-27
• 3.2.8 重组质粒的小量提取27-28
• 3.2.9 重组质粒的鉴定28
• 3.2.10 质粒的中量提取28-29
• 3.2.11 质粒的无菌化处理29
• 3.3 细胞培养与转染29-31
• 3.3.1 细胞培养29-30
• 3.3.2 转染30-31
• 3.4 免疫印迹(Immunoblotting,IB)31-33
• 3.4.1 蛋白样品的制备31
• 3.4.2 SDS-PAGE胶的配制31-32
• 3.4.3 上样电泳32
• 3.4.4 转膜32
• 3.4.5 IB检测32-33
• 3.5 脑组织免疫荧光33-34
• 3.5.1 脑组织提取及组织切片33
• 3.5.2 免疫荧光33-34
• 3.6 流式细胞术34
• 4 结果34-49
• 4.1 ROP18质粒的构建及在N2a神经细胞中的表达34-36
• 4.2 高表达ROP18转基因弓形虫促进小鼠脑神经元的凋亡36-39
• 4.3 ROP18促进N2a神经细胞的凋亡39-42
• 4.4 ROP18通过内质网应激途径促进N2a神经细胞的凋亡42-49
• 4.4.1 Caspase-12抑制剂预处理对ROP18诱导的神经细胞凋亡的影响42-45
• 4.4.2 Caspase-12抑制剂预处理对ROP18引起的凋亡相关蛋白表达的影响45-49
• 5 讨论49-50
• 6 结论50
• 7 创新点50
• 8 参考文献50-55
• 附录55-57
• 致谢57-58
• 综述58-67
• 参考文献64-67

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8 北京友谊医院北京热带医学研究所研究员 甘绍伯 副主任医师 冯曼玲;弓形虫——宠物的“宠物”[N];健康报;2000年

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7 古一;弓形虫CK1α缺失株感染小鼠毒力试验及机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

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本文编号：654699