类鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性研究

发布时间：2017-08-13 10:17

  本文关键词：类鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性研究

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【摘要】：类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,简称类鼻疽菌)是一种革兰阴性杆菌,主要存在于水或土壤中,可经由呼吸道吸入、消化道摄入、皮肤侵入等方式进行传播,主要侵犯人体肺部,可引起以肺炎、肺部空洞及肺部脓肿为特点的类鼻疽病,还可导致皮肤、肾脏、肝脏等多器官脓肿,严重者还可能发展为急性败血症而导致死亡。类鼻疽作为一种新发现传染病,诊断困难、致病性强、临床用药治疗困难,并且潜伏期较长,流行地区死亡率高达40%;其流行区域主要分布在南、北纬二十度内,涵盖新加坡、澳大利亚、越南、柬埔寨、马来西亚、老挝、泰国东北部等地区以及我国香港、台湾、广东、海南等地区,越来越多的证据表明它是一种正在全球扩散的人兽共患传染病,目前尚无批准使用的有效类鼻疽疫苗,因此亟待加强类鼻疽的相关研究。毒力因子在细菌致病过程中发挥重要作用,类鼻疽菌的毒力因子主要有III型分泌系统、VI型分泌系统、荚膜多糖、鞭毛、菌毛、群体感应分子、脂多糖等。2011年被发现的类鼻疽伯克霍尔德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor 1,BLF1),由bpsl1549基因编码,结构类似于大肠杆菌的细胞毒力因子CNF1-C,主要通过抑制e IF4A解旋酶的活性干扰蛋白质的翻译起始阶段,引起肌动蛋白细胞骨架的改变,并最终导致宿主细胞死亡。类鼻疽的死亡率较高,而BLF1作为类鼻疽菌第一个被发现的致死因子,其重要性不言而喻,获取该毒素对研究其致病机制以及指导类鼻疽的诊断和防治具有重要意义。近年来,随着蛋白合成抑制剂在抗肿瘤治疗方面的效果逐渐被认可,人们对蛋白质翻译起始因子e IF4A的抑制剂在靶向抗肿瘤治疗中应用的关注度也越来越高。BLF1作为潜在的eIF4A解旋酶活性抑制剂,能够抑制蛋白质的合成。那么我们可以设想,如果将该毒素递送至肿瘤细胞后,毒素是否具有广谱杀伤肿瘤细胞的作用呢?目前国内外尚无相关的研究报道。本研究的主要目的是通过基因工程技术重组表达BLF1(rBLF1)蛋白,并初步研究BLF1对肿瘤细胞的杀伤作用,为该蛋白在抗肿瘤治疗中的应用提供依据。方法:1.以BPC006菌株的全基因组DNA为模板,PCR扩增bpsl1549基因,目的基因与pGEX-6P-2载体质粒同时进行BamHI/Xho I双酶切,酶切产物经回收、连接后转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,氨苄抗性LB平板筛选阳性克隆,双酶切及DNA测序验证。2.IPTG诱导阳性重组子表达GST-BLF1融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白并经PSP酶酶切后获得rBLF1蛋白。以纯化rBLF1蛋白免疫新西兰兔,制备抗BLF1血清,并通过Western blot及ELISA法鉴定。3.A549细胞模型中,通过CCK-8实验研究目的蛋白的细胞毒性效应及抗体阻断作用。不同浓度r BLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,观察小鼠生存率。结果:1.从类鼻疽菌基因组DNA中PCR得到了编码BLF1的目的基因,并通过p GEX-6P-2载体成功构建了高效表达BLF1的工程菌株。2.经过二步亲和层析得到了分子量为23kD的高纯度r BLF1,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1:1 280000,Western blot鉴定在目的蛋白位置处出现特异印迹条带。3.rBLF1蛋白能明显杀伤A549细胞,抗体可有效阻断其杀伤作用。4.rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率随蛋白剂量的增加而升高,同时正常小鼠对低剂量BLF1表现出一定的耐受性。结论:重组表达了具有生物活性的rBLF1,该蛋白具有明显杀伤A549肿瘤细胞的作用,同时能够导致小鼠死亡,但表现出一定耐受性。以上结果为进一步研究类鼻疽菌的致病机制、寻找有效防治手段以及开发该毒素在抗肿瘤中的应用奠定了基础。
【关键词】：类鼻疽菌 毒力因子 细胞毒性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 英文摘要7-9
• 中文摘要9-11
• 1. 前言11-14
• 2. 实验材料14-20
• 3. 实验方法20-33
• 4. 实验结果33-42
• 5. 讨论42-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-49
• 文献综述 类鼻疽菌重要毒力因子Hcp149-58
• 参考文献55-58
• 附录58-61
• 攻读硕士学位期间取得的主要成果61-62
• 致谢62

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本文编号：666767